[发明专利]利用重组大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵领域，具体地说，涉及一种利用重组大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯(PHB)的方法。

背景技术

琥珀酸，学名丁二酸，是一种具有重要应用价值的四碳二羧酸，作为前体被广泛用于合成药品及生物可降解性聚合物。由于环境问题，许多研究已经转向于微生物发酵来生产琥珀酸。以可再生资源为原料的琥珀酸发酵法将逐步取代传统的化学合成法，通过代谢工程提高微生物琥珀酸的产量、降低琥珀酸发酵成本具有巨大的应用潜力。同时也存在着挑战，即构建以多种可再生碳源为底物的、易培养的、高转化效率、高产量的琥珀酸发酵菌株。目前，研究较多地菌株主要有产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniproducens)，产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)和大肠杆菌(Escherichia coli)等菌种。

大肠杆菌作为生产工业产物的宿主由于其遗传背景清楚、易操作、生长速率快、易培养及可利用多种碳源，而受到越来越多的重视。正是基于这些原因，大肠杆菌被认为是最有潜力生产琥珀酸的宿主。许多代谢工程策略已经用于提高大肠杆菌琥珀酸的产量。基因工程与发酵工艺的结合使得大肠杆菌大规模发酵琥珀酸成为可能。与A.succiniciproducens等其它微生物相比，大肠杆菌具有明显的优势。通过代谢工程的方法在大肠杆菌中生产琥珀酸已经实现。利用大肠杆菌好氧发酵琥珀酸的产量达到60g/L以上。但是琥珀酸发酵过程中，大量的菌体离心后扔掉，得不到利用。

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是细菌体内一种酯类的累积物，主要被用来作为碳源和能源的储备物。聚β羟基丁酸酯(PHB)是PHA的典型代表，它是一类新型的天然高分子材料，已经应用于环保、医药领域。PHB有良好的生物降解性，其分解产物可全部为生物利用，对环境无任何污染，其熔融温度为175～180℃，是一种可完全分解的热塑性塑料，由于良好的生物降解性、生物相容性、压电效应、光学活性等特点，PHB必将在环保、医药、光学材料领域发挥更重要的作用。

自然界中积累PHB的菌株主要有真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)、自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)。其中真养产碱杆菌已被用于商业生产PHB。然而PHB自然产生菌存在诸多的不利条件，如PHB颗粒不易提取，发酵周期长等。

大肠杆菌(E.coli)作为一种模式生物，同时由于其诸多的优点如：易培养、碳源利用范围广、生长速率快、易破碎、背景清楚等因而受到越来越多的研究。大肠杆菌本身不存在PHB合成途径，但通过基因工程可以将PHB合成途径构建在大肠杆菌内。为了降低成本，科学家们在改变细菌遗传结构上下了许多工夫，制造了新型聚合物，提高了产量，成本也明显降低。1987年，吉利亚James Madison大学的Dennis成功地从真养产碱杆菌中克隆到合成PHB的基因，并转入E.coli中，该菌株可以直接利用各种碳源，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖等廉价底物，进一步降低了成本。目前，PHB在大肠杆菌中的产量已经占到菌体干重的85％以上。但是，工业化生产PHB的成本仍然很高。

利用基因工程改造大肠杆菌，可突破传统的发酵模式。实现对PHB和琥珀酸的发酵联产，具有重要的实用意义。

发明内容

针对目前PHB发酵和琥珀酸发酵生产中的缺陷，本发明要解决的问题是提供一种利用重组大肠杆菌菌株高效联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯(PHB)的方法。

本发明选择大肠杆菌作为基因工程改造的对象菌株，所用大肠杆菌菌株为MG1655、JM109、DH5α、W3110或X11-blue中的一株。其中MG1655、JM109和W3110来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；DH5α与X11-blue来源于DSMZ(德国微生物保藏中心)。真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)购买于CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)。肥大产碱杆菌(Alcaligenes latus)、自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)购买于ATCC(美国典型菌种保藏中心)。

本发明的技术方案是：利用基因工程改造大肠杆菌，在同一菌株内构建琥珀酸合成代谢途径和PHB合成代谢途径。