[发明专利]利用重组大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法

权利要求书

1.一种利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法，步骤包括

(1)在大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径；

(2)在所构建琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中构建聚β羟基丁酸酯发酵途径；获得联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的重组大肠杆菌；或者：

(1)在大肠杆菌中构建聚β羟基丁酸酯发酵途径；

(2)在所构建聚β羟基丁酸酯发酵途径的大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径；获得联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的重组大肠杆菌；

(3)发酵联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的重组大肠杆菌并检测琥珀酸和聚β羟基丁酸酯；

其特征是：步骤(1)所述在大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径是通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655、JM109、DH5α、Xl1-blue或W3110中敲除基因sdhAB和iclR，构建琥珀酸好氧发酵途径；步骤(2)所述在所构建琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中构建聚β羟基丁酸酯发酵途径是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)的聚β羟基丁酸酯合成酶基因phbCAB克隆至质粒pBluescript SK^-、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99-A中，并转化到已构建有琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中，获得联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的重组大肠杆菌；或者步骤(1)所述在大肠杆菌中构建聚β羟基丁酸酯发酵途径是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)的聚β羟基丁酸酯合成酶基因phbCAB克隆至质粒pBluescript SK^-、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99-A中，获得聚β羟基丁酸酯表达重组质粒并转化大肠杆菌MG1655、JM109、DH5α、Xl1-blue或W3110，得聚β羟基丁酸酯发酵途径的大肠杆菌；步骤(2)所述在所构建聚β羟基丁酸酯发酵途径的大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径是将sdhAB和iclR基因敲除，获得联产聚β羟基丁酸酯和琥珀酸的重组大肠杆菌；步骤(3)所述联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的重组大肠杆菌的发酵条件是：摇瓶：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间48h～72h；发酵罐：温度设为30～40℃，溶氧控制在50％以上，pH 6.5～7.5，发酵时间72h～150h。

2.根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法，其特征是：步骤(1)所述的大肠杆菌是大肠杆菌MG1655或大肠杆菌DH5α。

3.根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法，其特征是：步骤(1)所述在大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径中敲除基因sdhAB和iclR所用的引物分别为：

pKD-sdhAB primer1

5′-GGGCCACACGCGAAACTGAAACTCGATCACCTGGGTAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-sdhAB primer2

5′-GCCTGATGCGACGCTTGCGCGTCTTATCAGGCCTACGGTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′

pKD-iclR primer1

5′-ATGAAAATGATTTCCACGATACAGAAAAAAGAGACTGTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-iclR primer2

5′-TATGATGGGCAGAATATTGCCTCTGCCCGCCAGAAAAAGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′。

4.根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法，其特征是：步骤(1)所述在大肠杆菌中构建聚β羟基丁酸酯发酵途径中获得聚β羟基丁酸酯合成酶基因phbCAB所用的引物分别为：

phbCAB primer 1：5′-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3′

phbCAB primer 2：5′-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3′。