[发明专利]一种羊X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种家畜X/Y精子分离技术，特别涉及一种羊X/Y精子分离冷 冻精液及其生产方法和应用。

背景技术

以家畜为主的冷冻精液、人工受精和体外受精技术广泛应用于生产繁育和 生殖生物学研究。在正常情况下，羊(绵羊和山羊)的子代繁育公母各占50％， 但是在生产实际中，为了提高羊(绵羊和山羊)的养殖效应，对于特定品系需 要更多繁育母羔(绵羊、山羊育种和扩群)或公羔(商品羊肉生产、商品羊绒 生产)，于是就需要通过分离X/Y精子来控制羊(绵羊和山羊)的子代性别。 CN1232231C公开了一种家畜X/Y精子分离的方法，但该方法需要使用磷酸缓 冲溶液洗涤精液，通过流式细胞分离机分离，其速度为3000个/秒。然而，使用 该方法分离羊的X/Y精子时，其分离速度、分离准确率、缓冲液使用、冷冻保 存后的精子活力等方面仍有较大提高空间。

CN101112392A公开了一种底剂量家畜精液及其生产方法，该方法通过使 用冷冻平衡液A(Tris-A)和添加了甘油的冷冻平衡液B(Tris-B)来处理多种家畜 精液，通过多种动物精液生理特性研究，发现特定异种动物精子间的受精促进 效果。该方法需要添加异种家畜的精液，使用该方法的山羊+绵羊精子冷冻液的 受胎率为51％，在仍有提升的空间。

发明内容

本发明的目的是提供羊X/Y精子分离冷冻精液的生产及方法和应用，可以 将羊X/Y精子分离，并实现产业化生产和应用，从而控制羊的子代性别。

本发明提供了一种羊X/Y精子分离冷冻精液，包括冷冻平衡液A、冷冻平 衡液B和羊X或Y精子分离冷冻精液，其含量如下：

冷冻平衡液A  Tris-A  50％

冷冻平衡液B  含12％甘油冷冻保护剂的Tris-B  50％，其中：

羊X或Y精子分离冷冻精液浓度为50-200万精子/0.25mL。

上述冷冻平衡液A，pH 6.8，由以下组分组成：

冷冻平衡液B，pH 6.8，由以下组分组成：

本发明还提供了上述羊X/Y精子分离冷冻精液的生产方法，包括下述步骤：

1)从健康的公羊采集新鲜精液2-5mL(总精子数25-50亿个)，为抑制精液 中细菌增殖添加抗生素(泰乐菌素Tylosin：0.103mg/mL，庆大霉素 Gentamicin：0.508mg/mL，林可-奇霉素Linco-spectin：0.6mg/mL)，在18-20℃条 件下保温，每份新鲜精液在该条件下可使用10-12小时；

2)使用精子密度-活力仪检测新鲜精液的浓度和活力，只有活力在80％以 上的样品可用于分离处理，根据精液浓度折合体积取4亿精子离心去除精浆， 添加10μg/mL Hochest 33342在24℃温水浴中染色20分钟；

3)羊X/Y精子分离的DNA含量差异设定为3.2-3.4％，根据羊X/Y精子 DNA含量差别设定流式细胞分离机参数(第一相区初取精子喷流总数的80％/ 第二相区原精液死精率10％＝X/Y单性精子分离取率45-47％)，通过流式细胞分 离机分离X和Y精子，使羊X/Y精子分离速度控制在5000-7000个/秒，X或Y 精子分离纯度达到85-95％；

4)根据分离精子累计显示，取经过分离的X或Y精子按1-1.1亿，下机后 以2000转/5分钟离心处理，用显微镜-电脑精子记数法检测分离精子浓度，用 冷冻平衡液A稀释到最终设计浓度的2倍，在4-5℃条件下放置90分钟以上；

5)冷冻平衡液A平衡后，添加等量的含12％甘油冷冻保护剂的冷冻平衡液 B，在4℃下平衡30分钟；

6)4℃条件下把步骤5)得到的经分离的X或Y精液装入冷冻管，制成含 羊X/Y精子分离冷冻精液。

7)因为冷冻保护液的效果不同，进一步将步骤6)制得的羊X/Y精子分离 冷冻精液置入-90℃的氮蒸汽中处理20-30分钟；当温度降到-120℃时，把冷冻 管投入液化氮中保存。

上述羊X/Y精子分离冷冻精液用于常规人工授精或手术人工授精方法，每 只受体一次可输入50-200万分离精子，按照生产需要定向繁育公羔或母羔；或 者，通过羊X/Y精子分离冷冻精液生产性控胚胎，再进行胚胎移植加快优良个 体的繁育速度。