[发明专利]一种羊X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用

权利要求书

1.一种羊X/Y精子分离冷冻精液的生产方法，包括下述步骤：

1)采集公羊新鲜精液2-5mL，添加抗生素，在18-20℃条件下保温；

2)检测新鲜精液的浓度和活力，只有活力在80％以上的样品可用于分离处 理，根据精液浓度折合体积取4亿精子离心去除精浆，添加10μg/mL Hochest 33342在24℃温水浴中染色20分钟；

3)羊X/Y精子分离的DNA含量差异设定为3.2-3.4％，根据羊X/Y精子 DNA含量差别设定流式细胞分离机参数为第一相区初取精子喷流总数的80％/ 第二相区原精液死精率10％＝X/Y单性精子分离取率45-47％，通过流式细胞分 离机分离X和Y精子，使羊X/Y精子分离速度控制在5000-7000个/秒；

4)取分离的X或Y精子1-1.1亿，下机后以2000转/5分钟进行离心处理， 然后用冷冻平衡液A稀释到50-200万精子/0.25mL的2倍，在4-5℃条件下放置 90分钟以上，其中冷冻平衡液A的pH为6.8，由以下组分组成：291.7mM的 三羟甲基氨基甲烷、95.1mM的柠檬酸、70.2mM的果糖、20％的卵黄和超纯水；

5)所述冷冻平衡液A平衡后，添加等量的冷冻平衡液B，在4℃下平衡30 分钟，其中所述冷冻平衡液B的pH 6.8，由以下组分组成：291.7mM的三羟甲 基氨基甲烷、95.1mM的柠檬酸、70.2mM的果糖、20％的卵黄、12％的甘油和 超纯水；

6)把分离X或Y精液在4℃条件下装入冷冻管，制成羊X/Y精子分离冷冻 精液。

2.根据权利要求1的所述的生产方法，其特征在于：所述抗生素为泰乐菌素 0.103mg/mL，庆大霉素：0.508mg/mL，林可-奇霉素：0.6mg/mL。

3.根据权利要求1所述生产方法生产的羊X/Y精子分离冷冻精液在人工受精或 者生产性控胚胎并进行胚胎再移植中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：其中取所述羊X/Y分离冷冻精液 人工授精剂量为50-200万精子/只或次。