[发明专利]一种对氧化还原循环反应剂敏感的报告菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过分子生物学手段，利用代谢工程改造的细菌菌株，具体涉及一种对氧化还原循环反应剂高敏感的大肠杆菌报告菌株、制备方法及其在检测氧化还原循环反应剂方面的应用。

背景技术

近年来，工业迅猛发展，人们生活条件改善，对于环境问题也越来越关注。“环保、生态、绿色、健康”已成为21世纪人们生活的主题概念。

氧化还原循环反应剂(redox cycling reagents)是一类较严重的工农业污染物，该类物质具有酶的特性，使细胞持续性产生超氧阴离子，同时造成细胞内还原当量(NADH/NADPH)大量消耗，所产生的超氧自由基能够引起机体氧化应激，氧化应激参与很多疾病如神经退行性变、癌症和衰老等的发生过程，还参与动脉粥样硬化和心脏病的进展，也和血管生成以及心血管状态的调节有关。环境中的这种物质增多会恶化生态环境，污染水源食物，严重威胁着人们的健康。

目前已经发展了一些物理化学方法，利用质谱仪、气相色谱仪及其它现代化的仪器对氧还循环反应剂进行精确监测，但是，这些物理化学方法需要昂贵的仪器和专门的实验室，更重要的是，这些技术虽说能够精确定量污染物，但是不能提供这些污染物的生物有效度、细胞内潜在的修饰/去毒作用以及体内的协同/拮抗效应等生物学关键信息。

因此，有必要发展一种生物传感器来对这些有毒物质进行检测。在过去的十几年里，利用生物检测技术来检测特殊污染物的研究引起了广泛的关注，生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件：1)针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；2)由感应器控制的启动子；3)受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易维护等优点而受到研究人员普遍亲睐。

使用生长曲线法、终点法、MIC法来检测菌株对氧化还原循环反应剂的敏感性均有一定的局限性，不能很好地反应细菌对氧化还原循环反应剂的敏感性，细菌培养时间长，多次重复试验耗时耗力，不利于快速检测。平板计活菌法检测细菌对氧化还原循环反应剂的敏感性，则不能连续监测氧化还原循环反应剂作用下的细菌生长状态，且该方法测定周期较长，主观误差大，准确度不高，故也不能很好检测出细菌对氧化还原循环反应剂的敏感性。所以需要进一步的改建菌株以快速而敏感地检测出细菌对氧化还原循环反应剂的敏感性。

对于氧化还原循环反应剂的生物传感器的研究主要基于大肠杆菌中SoxR和OxyR两个转录因子的研究。现在已经比较清楚大肠杆菌针对氧化还原循环反应剂反应的分子机理，两种氧还反应转录因子，SoxR和OxyR，主要负责介导细胞对氧化还原循环反应剂的反应。SoxR包含两个结构域：N端的螺旋-转折-螺旋DNA结合结构域和C端的调节结构域。SoxR C端的四个半胱氨酸残基(Cys)作为氧还活性簇(2Fe-2S)的配体。纯化的SoxR是一同源二聚体，每一单体包含一个氧还活性簇(2Fe-2S)。在普通培养条件下，SoxR(2Fe-2S)簇处于还原状态，无任何转录活性。当在培养基中加入氧化还原循环反应剂时，SoxR立即被氧化，并刺激其唯一目标其因SoxS的表达。其产物SoxS是ara-c相关转录激活子，诱导36种基因，包括含有Mn的过氧化物歧化酶，检酸内切酶IV，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，延胡索酸酶C，乌头酸酶A和NADPH-铁氧还蛋白氧化还原酶基因的表达。当大肠杆菌接触氧化还原循环反应剂时，还原状态的SoxR(2Fe-2S)簇立即被氧化。还原态(2Fe-2S)簇的氧化即显示出SoxR转录活性，刺激目标基因SoxS表达的能力可增高达100。由SoxR对SoxS直接而强有力的诱导控制可以推测SoxR及其目标SoxS启动子可以用作检测氧化还原循环反应剂的绝佳的生物检测系统。