[发明专利]DNA结合蛋白的定量方法及定量用试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种DNA结合蛋白的定量方法及定量用试剂盒。

背景技术：

作为从生物试样那种含杂质的试样中定量靶DNA结合蛋白的方法，有EP1138781公开的方法。根据此方法，对使靶DNA结合蛋白特异性结合到探针的复合物进行分离，再用免疫学定量法或PCR法定量所得复合物。

从试样分离出含有靶DNA结合蛋白和探针的复合物是一项很烦琐的操作过程。用免疫学定量法或PCR法定量复合物中所含靶DNA结合蛋白和DNA也同样费事。因此，运用EP1138781公开的方法获得定量结果需要很长时间。

US2006166237中提出了一个利用荧光相关光谱法仅从含有若干蛋白质的试样中快速检测出靶DNA结合蛋白，不进行分离、洗涤操作的方法。

根据US2006166237的实施例，用荧光标记DNA探针可以检测出生物试样的核提取物中的转录因子AP-1和NF-kB。在所用DNA结合探针与靶转录因子的结合反应中，转录因子的浓度与所测并进扩散时间有相关性。添加激活转录因子(AP-1)的刺激因子(TNF-α)与标记DNA探针转录因子复合物之间也显示有相关性。

荧光相关光谱法是一种测定液态试样所含分子的布朗运动所花费的并进扩散时间的方法。根据US2006166237所述方法，通过延长探针和蛋白质形成复合物所需的并进扩散时间，检测与探针特异性结合的蛋白质。然而，液态试样中的分子的布朗运动易受溶液粘度的影响。在此，生物试样往往含有大量作为杂质的蛋白质等高分子物质。因此，即使生物试样中靶蛋白质与探针的复合物数量相同，也有可能受液体试样所含高分子物质的影响，导致所测扩散时间发生变化。

另外，EP1835283公开了一种通过测定炎症细胞因子的转录因子，进行含败血症在内的全身性炎症症候群(SIRS)的辅助诊断的方法。SIRS每时每刻病情都在发生变化，需要根据病情实施治疗。因此，人们希望在一小时之内能够定量作为诊断依据的靶蛋白的量。需要分离、洗涤靶蛋白的定量方法可以用于体检那种不急的蛋白定量。而无法用于需要快速定量采自患者的试样中所含靶蛋白量这种病情变化的诊断。因此，需要用荧光相关光谱法等快速测定转录因子。

如上所述，特别是在病情变化的诊断中，人们一直寻求一个用荧光相关光谱法更准确地定量作为DNA结合蛋白的NF-κB和AP-1等转录因子的方法。

发明内容：

本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。

本发明的目的是提供一种用荧光相关光谱法准确定量诸如生物试样等含杂质的试样中所含靶DNA结合蛋白的方法及其定量用试剂盒。

即，本发明提供：

一种定量液体试样中的靶DNA结合蛋白的方法，包括以下步骤：

混合第一测定用试剂和液体试样，制备第一混合液，测定第一混合液中的第一并进扩散时间，其中，第一测定用试剂含有荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针，靶DNA结合蛋白可结合到荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针；

混合第二测定用试剂和液体试样，制备第二混合液，测定第二混合液中的第二并进扩散时间，其中，第二测定用试剂含有荧光标记核酸探针和第二非标记核酸探针，靶DNA结合蛋白不能结合到第二非标记核酸探针；及

根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差，定量液体试样中所含靶DNA结合蛋白。

所述定量步骤是根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差以及表示靶DNA结合蛋白量与并进扩散时间关系的数据定量液体试样中所含靶DNA结合蛋白的。

所述表示靶DNA结合蛋白量与并进扩散时间关系的数据是校准曲线，通过用荧光相关光谱法测定混合含荧光标记核酸探针的溶液和含一定量靶DNA结合蛋白的溶液制备的混合液中的并进扩散时间而获得。

第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的量比第一测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多；第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的量比第二测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多。

第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的浓度与第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的浓度相同。

所述液体试样含核提取物。

靶DNA结合蛋白为转录因子。

转录因子是细胞因子的转录因子。

荧光标记核酸探针的核酸序列与第一非标记核酸探针的核酸序列相同。

荧光标记核酸探针、第一非标记核酸探针和第二非标记核酸探针的至少一个形成茎环结构。