[发明专利]含乙二胺四乙酸和聚乙烯亚胺的组合、能透化微生物细胞壁的新组合物

说明书

本发明涉及能透化微生物细胞壁的新组合物，其包含乙二胺四乙酸(EDTA) 和聚乙烯亚胺(PEI)的组合，本发明也涉及该组合物的应用，特别是在液体或气 体介质中计数和/或鉴定靶微生物的方法中进行应用。

本发明更特别应用于，例如进入食品和药品生产线的液体和气体介质的微 生物质量调控。

在该领域，待检测微生物量通常较少，因为它们被大量体积的水或气体所 稀释。然而，它们的鉴定必须肯定地确定。事实上，微生物控制必须使得能在 尽可能短的时间内检出作为所制造产品组合物的成分的流体的任何污染物，以 便能在合适情况下停止该产品的制备或分装并采取必要去污步骤。

为使所述微生物培养时间最小化，已发展出多种微生物检测方法。

包含液体经膜过滤的微生物检测方法，已在例如专利申请WO01/59157中 记载。根据该方法，含在液体样品中的微生物，在液体经膜后，会保留在滤膜 表面。将微生物在膜表面与琼脂培养基接触培养，培养一段时间要求形成肉眼 不可见微菌落。然后，将形成微菌落的细胞裂解，以释放三磷酸腺苷(ATP)和核 酸内含物。用ATP-生物发光法，将所释放ATP作为鉴定及定量活细胞的标记物。 ATP可作为化学发光反应的酶底物，其中，通过该反应可获得光信号然后用合 适的视频界面进行检测(例如：LCD相机)。以图象形式提供的所获信号，能使 可原位看见微生物生长的膜位点，这与在细菌培养皿琼脂培养基上进行的传统 计数方式类似。在该实例中检测被认为是普遍通用的，因为ATP是在所有活微 生物中都存在的标记。因此，该方法不能区分不同种属的微生物。

Millipore公司出售的系统，就是用上述记载原理进行的 操作。该系统被设计成在同一膜上进行过滤和检测步骤，其中，所述膜用塑料 支持物进行支撑。对该支持物进行设计，以使其能嵌入各种装置用于过滤、微 生物培养、和检测。

与传统细菌培养皿检测相比，该微型系统能节省大量时间。此外，该方法 也能存储数码介质所获的图象，所述图象在对分析产品进行追踪的情况下，是 有利的。

然而，该系统因为以下事实而具有某些局限性：在实践中，对膜表面微生 物进行计数，是在细胞裂解之后进行的。进行该裂解是必需的，以从细胞提取 发光试剂反应产物，例如ATP而产生待检测发光信号。然而，在对膜进行处理 之后，就很难再利用该膜进行例如精确鉴定所检测微生物的其它分析。

可利用与微生物所含核酸(DNA或RNA)特异性杂交的探针鉴定微生物。 最常用的这类探针，包含通常长度为10-40核苷酸的寡核苷酸片段，所述片段与 微生物DNA或RNA所含序列可形成互补序列。

PNA(肽核酸)类探针，也认为在该类检测中有利，因为它们具有对微生物 中所存在降解酶不太敏感的肽骨架，而且，该肽核酸也提供了一种不同标记手 段。

专利申请WO2004/050902记载了一种膜检测系统，所述系统在不引起微生 物任何裂解的情况下，可检测血样是否存在微生物污染。该系统的特点在于， 通过将标记试剂经细胞壁透化至微生物中而进行检测。所用标记试剂为小尺寸 分子，特别是那些可嵌入核酸(DNA，RNA)的化合物，例如花青素衍生物， 碘化丙啶，吖啶橙，或溴化乙啶。利用现有技术已知的透化剂，例如聚乙烯亚 胺(PEI)，洋地黄皂苷，莫能菌素，六偏磷酸钠或氯化苄烷铵，上述小分子化合 物可相对容易经膜透化至微生物中。首先，将含待测微生物液体试样在细胞透 化剂存在情况下，稀释于含标记试剂的透化溶液，然后，将微生物经膜过滤由 此检测。该方法可以良好分辨率来检测微生物。

然而，由于标记是通用标记，即该标记对微生物不具有特异性，所以，该 系统并不能精确确定所检测微生物的种类。

此外，该系统的微生物操作(在透化液中温育)要在溶液中进行，而由此 需要特定预案和复杂装备。应该注意，过滤前将活细胞在溶液中温育还有下列 缺点——在膜固定前所述细胞能继续生长和分化，由此实际上可导致检测最终 结果具有不确定性。

与该类分析相关的另一困难在于，必须用于透化溶液的透化剂用量。事实 上，该用量应根据待测微生物类型而变化。例如，根据微生物(在细菌例子中) 是革兰氏阳性还是革兰氏阴性类型，透化剂在同一浓度下会有不同效果，更坏 的是，该效果将会导致所存在微生物裂解。