[发明专利]运用复合PCR技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法

说明书

技术领域

本发明“运用复合PCR技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法”，属于农作物病害防治和植物检疫技术领域。

背景技术

芦笋作为一种食药兼用的高档蔬菜，不仅口味鲜美，还是当今世界发现和公认的防癌抗癌效果最好的植物，深受国内外广大消费者的喜爱。我国是世界上最大的芦笋生产国和出口国，主要的芦笋种植区分布在山东、江苏、浙江、山西、福建、河北等省份，生产的芦笋大部分用于出口。

腐马素是一组主要由串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)和再育镰刀菌(Fusariumproliferatum)等镰刀菌属真菌产生的真菌毒素，具有分布广，毒性强的特点。已成为继黄曲霉素之后的又一个真菌毒素研究的新热点。现已鉴定到28种腐马素类似物(Hlywka andBullerman，1999)，它们被分为4组，即A、B、C和P组。其中，B组腐马素是野生型菌株中产生量最为丰富的一组。目前已发现的腐马素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11种，其中FB1是其主要组分，占75％以上，而且毒性最强。许多证据表明，腐马素对某些牲畜有急性致命毒性及潜在的致癌性，如引起马脑炎、猪肺水肿或大鼠肝癌等，为畜牧业带来很大的损失。流行病学研究也认为，食用腐马素会引起人类食道癌和神经管缺陷，严重威胁食品安全及人类和动物健康。在2003年，国际癌症研究机构(International Agency of Research Cancer，IARC)估测由串珠镰刀菌产生的腐马素(FB1)为2B组，即可疑人类致癌物。

目前，在许多国家如美国、意大利、德国、荷兰、南非和澳大利亚等的芦笋产区，镰刀菌侵染引起的病害己是芦笋上的主要病害，并且己有研究报导了FB1，FB2在田间芦笋上的发生，严重影响芦笋的产量和产品质量。而串珠镰刀菌和再育镰刀菌是芦笋中极为常见的病原真菌，发生非常普遍，并且通常情况下大部分植株在田间感染了致病菌之后无明显症状，一些无明显霉变症状的产品也可能有腐马素污染。

中国是世界上已经确认的食品中腐马素的污染与食道癌的发生关系密切的两个国家之一，因此控制芦笋、玉米等食品中腐马素的污染是当务之急，在农业生产和食品安全领域都有非常重要的意义。较全面地了解主要产地中芦笋上腐马素产毒菌株污染情况，建立完善、快捷的腐马素及其产毒株的检测手段和监控机制也势在必行。只有这样才能及时有效地发现和控制有关腐马素的污染，及时采取措施，从而提高我国农产品在国际市场上的质量和信誉，保证国际贸易的顺利进行，保护广大农民的切身利益。

传统的腐马素产毒菌株的分类和鉴定方法主要为形态学方法，该法需要较高的专业素质和经验并需要通过菌株分离，培养，纯化，促进产孢等一系列过程，需时约30天，费时费力。在生产实际鉴定应用和科研中，都有较大局限性。随着对腐马素研究的深入，其生物合成途径已基本阐明，使利用分子生物学方法对腐马素产毒菌株分类和鉴定成为可能。目前分子检测手段大多以分类学基因和腐马素生物合成所必需的聚酮化合物合成酶基因FUM1为基础的，设计组特异性或属特异性引物进行PCR扩增检测，耗时可缩短到2天。但是，由于分类学基因是基于镰刀菌属内各个种的同源序列设计的，直接揭示菌株种类，而并不能直接揭示待测菌株的产毒性，很可能将未知的腐马素产毒菌株排除在外。而目前扩增直接与腐马素产毒机制相关基因的引物是基于已知产毒菌株F.verticillioides的FUM1基因序列设计的，但腐马素的合成是一个比较复杂的过程，多种基因的参与和调节，对于FUM1基因的单一检测并不能完全保证结果的可靠性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种简单、有效、快速的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法。