[发明专利]运用复合PCR技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法

权利要求书

1、一种运用复合PCR技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法，其特征在于：使用分别根据腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因和丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8设计的引物对rp32/rp33和rp679/rp680和镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组；在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株；其检测步骤为：对待检样品进行菌株分离和纯化；SDS法提取样品模板DNA；复合PCR反应；经电泳、染色、漂洗，用自动凝胶成像系统观察、扫描并储存电泳结果，最后经过谱图分析，得出检测结果。

2、根据权利要求1所述的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述菌株的分离和纯化的操作步骤为：芦笋样品清洗后切成2cm长小段，70％酒精消毒3min，10％次氯酸钠消毒7min，然后用无菌水冲洗3次；无菌条件下，将样品平铺到PDA培养基上，封口膜封口；置于培养箱中25℃暗培养，统计每个样品在PDA培养基上的菌落，观察真菌的生长，4-5天后在显微镜下观察真菌的性状特征，分出不同的真菌，将其从菌落中挑出，各自接种到PDA培养基上进一步培养；一种真菌接种于一个培养皿内，4-5天后，对纯化了的菌株进行单孢分离，准备3个倒有10ml无菌水的培养皿，用接种针挑取一小块菌丝放入一个培养皿中，用“L”型玻棒搅匀，蘸取少许溶液溶解在第二个培养皿中，同样方法处理第三个培养皿，得到三个不同数量级浓度的孢子悬浮液；分别从三个不同孢子悬浮液中蘸取少许液体涂在PDA平板上，高浓度一个，中等浓度2个，低浓度3个；25℃暗培养，每隔12h观察一次，若发现有菌落产生则用记号笔从培养皿的反面标记，用解剖针连同培养基一起挑取到新的PDA平板中；获得单孢培养物，纯化后菌株于4℃保存备用。

3、根据权利要求1所述的芦笋中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述SDS法提取样品模板DNA，其操作步骤为：

1)将菌株培养在50ml的液体酵母培养基中，在27℃，200rpm/min的振荡条件下，培养3-5天；

2)用Whatman滤纸过滤，抽滤收集孢子，在液氮中磨成粉，将粉末收集在50ml的试管中；

3)在试管中加入4ml DNA提取液并且涡旋使其充分混合；

4)加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，短时间涡旋振荡，2500g离心15min；

5)将上清液转移到2ml的离心管中，每支中加900ul，然后加900ul氯仿，13200rpm离心5min；

6)将上层溶液转移到新的2ml试管中，加入RNaseI终浓度C≥100μg/ml，然后在37℃培养2-3h；

7)将试管和5M氯化锂溶液在冰上放置15min；

8)往试管中加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min；

9)4℃下13200rpm离心10min，然后将所有的上清液一起都放在50ml的试管中；

10)加入2.5倍体积的100％乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合；

11)4℃下3000g离心20min，弃取上层清液；

12)加20ml70％的冷乙醇，然后在4℃下过夜，让杂质溶解；

13)4℃下3000g离心20min，弃去上层清液；

14)沉淀在空气中干燥15min，然后加入300-400μl重蒸水，在4℃下溶解过夜；

15)用移液器吸取溶液的办法使其混匀，获得样品模板DNA。