[发明专利]玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明“一种玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法”，属于农作物病害防治和植物检疫技术领域。

背景技术

腐马素是一组主要由串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides或Fusarium moniliforme)和再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)等镰刀菌属真菌产生的真菌毒素。它不但对某些牲畜有急性毒性及潜在的致癌性，如引起马脑炎、猪肺水肿或大鼠肝癌等，还能引起人类食道癌和神经管缺陷，严重威胁食品安全及人类和动物的健康。由于腐马素分布广，毒性强，已成为继黄曲霉素之后的又一个真菌毒素研究的新热点。近年来，玉米中腐马素水平的升高不仅引起玉米种植者的注意，还引起了牲畜饲养者、农业企业、食品工业、健康问题专业人士和政策制定者等的广泛关注。

中国是世界上已经确认的食品中腐马素的污染与食道癌的发生关系密切的两个国家之一，因此控制玉米等食品中腐马素的污染是当务之急，在农业生产和食品安全领域都有非常重要的意义。较全面地了解各地玉米及其制品上腐马素产毒菌株污染情况，建立完善、快捷的腐马素及其产毒株的检测手段和监控机制也势在必行。只有这样才能及时有效地发现和控制有关腐马素的污染，及时采取措施，从而提高我国农产品在国际市场上的质量和信誉，保证国际贸易的顺利进行，保护广大农民的切身利益。

目前，腐马素产毒菌株的分类和鉴定方法主要有形态学和分子生物学两种。其中，传统的形态学方法检测腐马素产毒菌株，需进行产毒培养、毒素提取和测定，需时约30天，费时费力。在生产实际鉴定应用和科研中，都有较大局限性。而分子检测手段大多以分类学基因和腐马素生物合成所必需的聚酮化合物合成酶基因FUM1为基础的，设计组特异性或属特异性引物进行PCR扩增检测，耗时可缩短到2天。但是，由于分类学基因是基于镰刀菌属内各个种的同源序列设计的，直接揭示菌株种类，而并不能直接揭示待测菌株的产毒性，很可能将未知的腐马素产毒菌株排除在外。目前扩增直接与腐马素产毒机制相关基因的引物是基于已知产毒菌株F.verticillioides的FUM1基因序列设计的，腐马素的合成是一个比较复杂的过程，受多种基因调节，对于FUM1基因的单一检测并不能完全保证结果的可靠性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种简单、有效、快速的腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法。

本发明的检测方法基于腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8、长寿保证因子基因FUM17，应用DNAman序列分析软件分别设计了多对引物，并与镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR一起，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组。在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株。是对仅根据分类学基因及FUM1基因设计特异性引物检测方法的补充和改进。对串珠镰刀菌之外的其他腐马素产毒菌株也可以检测到。同时，本方法采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在大规模推广。

本发明通过以下技术方案实现：

第一步：PCR引物设计

根据聚酮化合物合成酶FUM1基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8、长寿保证因子基因FUM17的基因序列，应用DNAman序列分析软件分别设计了多对引物。设计引物通过不断调整，直到得到特异性最佳的引物配组。复合PCR反应所用引物共四对，fum1-F/fum1-R、fum8-F/fum8-R、fum17-F/fum17-R和ItsR/ItsF，其引物序列如下：

fum1-F   GCAACTCACCTTACTCGCTATTC

fum1-R   TGTTCAGAGGGGTCTTTGGTTA

fum8-F   CACTGCATATGACTACCTCTTGGGAGGAT

fum8-R   CTCGAATTCGGACATGTCCCTCGCGATAA

fum17-F  CTTTTTCTAGCAACTTCTAAATCACTTAT

fum17-R  TTGCTCGAGTTAGTCCCCATGCTCGATTTC

ItsF     AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA

ItsR     TTTAACGGCGTGGCCGC