[发明专利]玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法

权利要求书

1.一种玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：基于腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8、长寿保证因子基因FUM17，应用DNAman序列分析软件分别设计了多对引物，并与镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR一起，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组；在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株；采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增；其检测步骤为：待检样品直接采用改良的SDS法提取模板DNA；然后经复合PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析得出检测结果。

2.根据权利要求1所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述改良的SDS法提取样品模板DNA，其操作步骤为：将玉米或其制品磨成粉，取0.2g置于50ml的试管中，加入4mlDNA提取液并且涡旋使其充分混合；加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，涡旋振荡，2500g离心15min；将上清液转移到2ml的离心管中，每支中加上清液900ul，氯仿900ul，13200rpm离心5min；将上层溶液转移到新的2ml试管中，加入RNase I，终浓度C≥100μg/ml，然后在37℃培养2-3h；加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min；4℃下13200rpm离心10min，然后将所有的上清液一起都放在一个50ml的试管中；加入2.5倍体积的100％乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合；4℃3000g离心20min，小心地弃取上层清液；加20ml70％的冷乙醇，4℃3000g离心20min，小心地弃去上层清液；沉淀在空气中干燥15min，然后加入300-400μlTE缓冲液或重蒸水ddH2O，用移液器吸取溶液的办法使其混匀；模板DNA母液贮存在-80℃条件下，使用前稀释成浓度为50ng/μl溶液，存放在-20℃条件下。

3.根据权利要求1所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述复合PCR反应所用引物共四对，fum1-F/fum1-R、fum8-F/fum8-R、fum17-F/fum17-R和ItsR/ItsF，其引物序列如下：

fum1-F             GCAACTCACCTTACTCGCTATTC

fum1-R             TGTTCAGAGGGGTCTTTGGTTA

fum8-F             CACTGCATATGACTACCTCTTGGGAGGAT

fum8-R             CTCGAATTCGGACATGTCCCTCGCGATAA

fum17-F            CTTTTTCTAGCAACTTCTAAATCACTT AT

fum17-R        TTGCTCGAGTTAGTCCCCATGCTCGATTTC

ItsF           AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA

ItsR           TTTAACGGCGTGGCCGC

其中fum1-F/fum1-R引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出635bp的产物，fum8-F/fum8-R引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出1152bp的产物，fum17-F/fum17-R引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出344bp的产物，ItsR/ItsF引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出431bp的产物。

4.根据权利1、3要求所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述复合PCR反应，其反应体系为：反应体系总体积为25μl，包括1.75μl的10×PCR缓冲液，1.5μl的25MmMgCl₂，1.0μl的10Mm dNTP，0.5μl的Taq酶，2μl的模板DNA，1.8μl的引物，其余以重蒸水补足。

5.根据权利4要求所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：1.8μl的引物中fum-1F、fum-1R、fum-17F和fum-17R各0.1μl，ItsF和ItsR各0.2μl，fum-8F和fum-8R各0.5μl。

6.根据权利1要求所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述复合PCR反应，其反应条件为：预变性温度94℃，时间5min；循环数33，变性温度94℃，时间30s；退火温度53℃，时间45s；延伸温度72℃时间1min；终延伸温度72℃，时间10min；在4℃保存。