[发明专利]猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪Sirt1(pSirt1)基因小干扰RNA(siRNA)表达载体的构建方法及 用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

Sirt1是酵母染色质沉默因子Sir2的哺乳动物同源体，是一种依赖于烟碱腺嘌呤二核 苷酸的组蛋白脱乙酰酶。Sirt1是一种核蛋白，它具有多种生物学功能，它不仅是一个重要 的与机体长寿有关的因子，而且可能在动物脂肪沉积和肌肉发育中起着关键的调控作用。 因此，开展Sirt1在动物脂肪代谢和肌肉发育中的功能研究具有重要的意义。

猪Sirt1(pSirt1)全长cDNA序列4024bp，GenBank登录号EU030283，编码区2226 bp，编码742个氨基酸，蛋白分子量80.9kDa，含有Sirt1蛋白家族的保守核心结构域； BLAST结果表明，pSirt1氨基酸序列与人、狗、牛、鼠同源性分别达到87％，92％，91％ 和82％。

RNA干扰(RNAi)技术作为一种新的基因阻断技术，具有低成本、高效性、高特异 性以及可传递性等特点，能特异、高效地抑制特定基因的表达，已经成为研究基因功能的 一种有力工具。由于干扰载体pSilencer4.1-CMV neo可以方便用于目的基因siRNA表达 载体的构建，从而可以特异性的使特定目的基因沉默，功能丧失，因此干扰载体pSilencer 4.1-CMV neo可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法，以及 该小干扰RNA表达载体的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法， 包括以下步骤：

1)、通过RACE技术克隆得到pSirt1全长cDNA序列；

2)、根据载体的信息和靶序列设计并合成4对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，该 9个核苷酸为：TTCAAGAGA；

3)、RNAi表达载体的构建：siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到 RNAi表达载体的重组质粒。

作为本发明的猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法的改进，步骤2)为：根据步 骤1)所得的pSirrt1全长基因序列，筛选并设计4对siRNA引物；该4对siRNA引物分 别为：

引物I：

S：5′-GATCCATCGTCACCAATGGTTTCCTTCAAGAGAGGAAACCATTGGTGACGATTTA-3′

AS：5′-AGCTTAAATCGTCACCAATGGTTTCCTCTCTTGAAGGAAACCATTGGTGACGATG-3′，

引物II：

S：5′-GATCCTTCCTCCACCTGAATTGGATTCAAGAGATCCAATTCAGGTGGAGGAATTA-3′

AS：5′-AGCTTAATTCCTCCACCTGAATTGGATCTCTTGAATCCAATTCAGGTGGAGGAAG-3′，

引物III：

S：5′-GATCCGAGATGGCATTTATGCACGTTCAAGAGACGTGCATAAATGCCATCTCTTA-3′

AS：5′-AGCTTAAGAGATGGCATTTATGCACGTCTCTTGAACGTGCATAAATGCCATCTCG-3′，

引物IV：

S：5′-GATCCTCCAGAGGATAATCCAGTGTTCAAGAGACACTGGATTATCCTCTGGATTA-3′

AS：5′-AGCTTAATCCAGAGGATAATCCAGTGTCTCTTGAACACTGGATTATCCTCTGGAG-3′。

作为本发明的猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，步骤3)为： 将pSilencer4.1-CMV neo质粒进行BamHI和HindIII双酶切后，与siRNA引物退火后得 到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌。