[发明专利]猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法及用途

权利要求书

1.一种猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1)、通过RACE技术克隆得到pSirt1全长cDNA序列；

2)、根据步骤1)所得的pSirt1全长基因序列，筛选并设计4对siRNA引物；所述4对 siRNA引物分别为：

引物I：

S：5′-GATCCATCGTCACCAATGGTTTCCTTCAAGAGAGGAAACCATTGGTGACGATTTA-3′

AS：5′-AGCTTAAATCGTCACCAATGGTTTCCTCTCTTGAAGGAAACCATTGGTGACGATG-3′，

引物II：

S：5′-GATCCTTCCTCCACCTGAATTGGATTCAAGAGATCCAATTCAGGTGGAGGAATTA-3′

AS：5′-AGCTTAATTCCTCCACCTGAATTGGATCTCTTGAATCCAATTCAGGTGGAGGAAG-3′，

引物III：

S：5′-GATCCGAGATGGCATTTATGCACGTTCAAGAGACGTGCATAAATGCCATCTCTTA-3′

AS：5′-AGCTTAAGAGATGGCATTTATGCACGTCTCTTGAACGTGCATAAATGCCATCTCG-3′，

引物IV：

S：5′-GATCCTCCAGAGGATAATCCAGTGTTCAAGAGACACTGGATTATCCTCTGGATTA-3′

AS：5′-AGCTTAATCCAGAGGATAATCCAGTGTCTCTTGAACACTGGATTATCCTCTGGAG-3′：

3)、RNAi表达载体的构建：siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到RNAi 表达载体的重组质粒；所述RNAi载体为pSilencer 4.1-CMV neo质粒。

2.根据权利要求1所述的猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是：所述步 骤3)为：将pSilencer 4.1-CMV neo质粒进行BamHI和HindIII双酶切后，与siRNA引物退 火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌。

3.根据权利要求2所述的猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是所述步骤1) 为：设计并合成pSirt1的特异性引物P1～P4，利用3′-RACE、5-RACE技术和pSirt1的特异性引 物P1～P4，克隆得到猪3′和5′端序列并对序列进行测序鉴定；将Sirt1的5′和3′序列拼接得到 pSirt1全长cDNA序列，将pSirt1全长cDNA序列登录到GenBank，利用NCBI上的BLAST工具对 pSirt1碱基序列和氨基酸序列进行比对；所述特异性引物P1～P4是：

P1：5′-GTTAGGAGGTGAATATGCCAAG-3′；P2：5′-CACGAACACAAAAAGAGTTGGC-3′；

P3：5′-AACTGGCATGTGAGGCTCTATC-3′；P4：5′-CAGAAGGTTATCTCGGTACCCA-3′。

4.根据权利要求1～3中任意一种猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是： 将步骤3)所得的RNAi表达载体进行鉴定：

通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为特异性上游引物 和RNAi干扰载体的本身引物：5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′；测序引物为： 5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′。

5.如权利要求1～4中任意一种方法所得的猪Sirt1小干扰RNA表达载体的用途，其特 征是：用于研究pSirt1基因对脂肪代谢产生的影响。

6.根据权利要求5所述的猪Sirt1小干扰RNA表达载体的用途，其特征是包括以下步骤：

(1)、将含pSirt1的siRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；

(2)、将含pSirt1的siRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞，37℃，5％的 CO₂中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基；

(3)、转染48h后，分析siRNA表达载体对pSirt1及脂肪代谢关键功能基因ATGL、HSL 和PPARγ表达的影响，研究Sirt1的功能。