[发明专利]运用重组多表位肽蛋白进行钩端螺旋体感染检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于医学免疫检测学技术领域，特别地，涉及一种运用重组多表位肽蛋白进行钩端螺旋体感染检测的方法。

发明背景

钩端螺旋体病是一种由钩端螺旋体菌感染而产生的动物传染性疾病：通过接触家养或野生的动物宿主或被它们尿液所污染的环境而传播给人。钩端螺旋体由8种致病的遗传相异类型和4种非致病的腐生种类组成。钩端螺旋体还按血清型情况进行了分类，目前已鉴定出了230多个致病血清变型。

钩端螺旋体病广泛分布于世界各地。由于大范围的动物物种可作为其宿主，所以该病被认为是最普遍的人畜共患疾病。该病的早期特征为发热、寒战、头痛和严重的肌肉痛，由于症状与出血热、感冒等相似而常被误诊。在临床感染中有5-15％的病人病情发展至产生诸如黄疸、肾机能不全和肺出血等严重的多系统并发症。严重的钩端螺旋体病死亡率为5-50％。

最近几年该病已出现了新的传播模式，突出显示了钩端螺旋体病正成为公共健康问题的严重性。在发达国家，钩体病成为消遣性活动和体育运动相关性疾病发作的原因。在发展中国家，贫困状况已造成了高死亡率钩体病在城市或乡村的广泛传播。不仅如此，钩体病还造成牛、猪、羊、马和狗等牲畜和家养动物的流产、死产、不育、不生长、产奶量低甚至死亡。

目前适当检测工具的缺乏阻碍了对人和动物钩体病的控制。虽然经过数十年的努力，在钩端螺旋体病的科研和防治方面已取得了一定的成就，但目前钩体检测方法主要有直接暗视野显微镜检查法、改良镀银染色法、凝集试验及凝集素吸收试验等。但这些方法不适合急性病例的鉴别。新发展的基于全细胞钩端螺旋体抗原制品的酶联免疫吸附检测法(ELISA)和其它快速血清学检测仍需要进行MAT以确认病例。钩端螺旋体病的发病机理依赖于感染早期病原体在宿主体内广泛散布的能力。钩体外膜蛋白被认为介导了使其能穿过并散布于宿主组织间的相互作用。此外，外膜蛋白在宿主感染期间可引发免疫反应，因此构成了通过抗体依赖型吞噬作用和补体介导型致死作用等机制而进行免疫保护的靶分子。最近有利用重组外膜蛋白作为钩端螺旋体病的血清学检测的方法，但由于钩端螺旋体的抗原结构复杂，血清型众多，用常规的以多抗血清为基础的血清学方法不利于该病的早期快速检测。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种运用重组多表位肽蛋白进行钩端螺旋体感染检测的方法

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种运用重组多表位肽蛋白进行钩端螺旋体感染检测的方法，采用钩端螺旋体外膜蛋白优势抗原决定簇的重组多表位肽为检测抗原构建试剂盒或试纸条，检测钩端螺旋体抗体IgM或IgG。

进一步地，它包括以下步骤：

(1)筛选钩端螺旋体外膜蛋白OmpL1、LipL21和LipL32的优势抗原表位；

(2)根据筛选的表位序列及表达系统的偏爱性，人工合成DNA序列并采用基因工程手段获得目的蛋白的编码基因；

(3)将合成的基因片段克隆到表达载体中并构建表达该目的蛋白的表达系统；

(4)根据表达系统的特点选用一定的纯化方法提纯目的蛋白并获得高纯度的产品；

(5)对所述步骤(4)获得的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，确定具有22kD分子量的特定蛋白存在；对目标蛋白进行Western Blot分析，确定所获得蛋白的免疫反应性。

(6)以获得的重组蛋白为抗原，构建ELISA检测试剂盒或试纸条，检测目标样品中抗钩体IgG或IgM的存在情况而实现对钩体病人的检测。

进一步地所述的目标样品为人或动物的血清、脑脊液等所有已经脱离人体或动物体的体液样品；所述的用于钩端螺旋体感染检测的方法是在体外进行的。

本发明的有益效果是：本发明用多表位串连表达蛋白作为抗原进行钩体病血清学检测具有特异、快速、方便、灵敏正确、结果可肉眼观察等特点，且该检测方法没有钩体不同血清型的限制，有利于其推广应用。

附图说明

图1为重组质粒的酶切图谱，图中，M1，50bp DNA marker；1，pBacPAK8/BamHI+EcoRI；2，pBacPAK8-1mp/BamHI+EcoRI；3，pBacPAK8-21mp/BamHI+EcoRI；4，pET28a/BamHI+EcoRI；5，pET28a-21mp/BamHI+EcoRI；M2，1kb DNA marker。