[发明专利]一种提高非病毒类载体介导的基因输运能力的方法

说明书

技术领域

本技术属于基因输运领域。它可以通过提高细胞自噬的水平提高非病毒类载体介导的基因输运的能力，同时对细胞毒性较低。

背景技术

基因输运是基因治疗的技术基础，基因输运能力直接影响基因治疗的效率。目前基因输运的载体主要包括病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体病毒类载体主要包括：逆转录病毒类载体(CN1871356，CN1159210，CN1302334)，慢病毒类载体(CN1688323，CN1487841，CN1668751，CN1633495，CN101186915)，腺病毒类载体(CN1857738，CN1650021，CN1570122，CN101072879，CN1147837，CN1113390，CN1218512，CN1314948)等，虽然病毒类载体具有较高的基因输运能力但是存在安全性的隐患。非病毒类载体包括：阳离子脂质体核心的载体(如Lipofectamine2000)，脂质体核心的载体(FuGene6)，阳离子聚合物核心的载体(CN101016550)，多胺类载体，肽类载体(CN1821399)，复合类载体(CN101016549)及其他生物材料类载体(CN1786163，CN1375334)等，虽然相对病毒类载体具有较高的安全性但是其输运能力始终制约着其应用。

细胞自噬是细胞在营养缺乏等外界刺激下的应激反应，通过形成双层膜结构将部分胞质和细胞器包裹形成自噬体后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将内含物消化并重新利用。细胞自噬在非病毒类载体介导的基因输运能力的关系未见报道，本发明第一次将细胞自噬水平同非病毒类载体介导的基因输运能力联系在一起，并通过提高细胞的自噬水平达到提高非病毒类载体介导的基因输运能力的目的。

发明内容

本发明的方法是通过提高细胞的自噬水平，显著提高非病毒类载体介导的基因输运能力，同时该技术具有比较低的生物毒性。

技术方案：本发明提高非病毒类载体介导的基因输运能力的方法是在非病毒类载体介导的基因输运的同时或之前的2小时内提高细胞的自噬水平。

提高细胞的自噬水平的方法包括：物理，化学及生物的刺激导致细胞自噬水平提高。

能提高细胞自噬水平的化合物有：可乐定(cloni dine)，双氧水(H2O2)，百草枯(paraquat)，砷盐(arsenic salts)，三苯氧胺(tamoxifen)，灰安毒素-3(grayanotoxinIII)，雷帕霉素(rapamycin)，氟司必林(fluspirilene)，三夫拉嗪(trifluoperazine)，双氟苯丁哌啶苯并咪唑酮(pimozide)，尼卡地平(nicardipine)，震颤毒素-A(penitremA)，尼古地平(niguldipine)，氯苯哌酰胺(loperamide)，胺碘酮(amiodarone)，海藻糖(trehalose)，氯化锂(LiCl)】。

其中所述的物理刺激为营养缺乏。

所述的生物刺激为导入提高细胞自噬水平的基因、导入细胞自噬抑制基因的SiRNA，ShRNA、拮抗剂或病毒接触。所述的导入提高细胞自噬水平的基因包括表达产物直接提高细胞自噬水平的基因；表达产物间接提高细胞自噬水平的基因；表达产物拮抗自噬抑制基因。

所述的导入提高细胞自噬水平的基因包括表达产物直接提高细胞自噬水平的基因为Atg基因系列；表达产物间接提高细胞自噬水平的基因为p53；表达产物拮抗自噬抑制基因为mTOR的抑制基因。

所述的拮抗剂为mTOR的SiRNA和ShRNA。

有益效果本技术通过提高细胞的自噬水平对非病毒类载体介导的基因输运能力的提高有显著效果，特别是难于转染的原代细胞[如成骨细胞(osteoblast)，肌肉细胞(myotube)和胚胎成纤维细胞(MEF)]。同时利用的非病毒载体的毒性较低，安全性高。

附图说明

图1：胚胎成纤维细胞(MEF)中自噬促进剂的作用(Luciferase作为报告基因)；

图2：成骨细胞(osteoblast)中自噬促进剂的作用(Luciferase作为报告基因)；

图3：肌肉细胞(myotube)中自噬促进剂的作用(Luciferase作为报告基因)；

图4：胚胎成纤维细胞(MEF-WT)中自噬促进剂的作用(GFP作为报告基因，western blot检测)；

图5：胚胎成纤维细胞(MEF-WT)中自噬促进剂的作用(GFP作为报告基因，流式细胞术检测)；