[发明专利]提高了热稳定性及蛋白酶抗性的环化植酸酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高了热稳定性及蛋白酶抗性的环化酶，本发明还涉及对蛋白酶进 行环化以提高其性能的方法。

背景技术

天然蛋白质，尤其是酶蛋白在稳定性方面的存在许多不足，比如耐热性差，易被蛋 白酶水解等，限制了它们在医药和工业生产中的应用。

例如，植酸酶(E.C.3.1.3.8)是一种可以将植酸水解为肌醇和磷酸的酶类。饲料中 添加植酸酶后可将植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸盐，供动物吸收利用，从而提高磷的 利用率和骨骼矿化程度，可节约磷资源、降低饲料成本。但植酸酶对热不稳定，而植酸 酶生产过程的制粒环节，温度为75-90℃，并要持续数分钟，在此过程中酶的活性会大幅 度的丧失，影响其在生产中的应用。因此提高植酸酶的稳定性成为急需解决的问题。

蛋白环化是一种新技术，环化的蛋白较之线型的蛋白有很多的好处，例如可增加蛋 白的稳定性，减少蛋白对水解酶剪切的抗性，增强蛋白的活性和减少蛋白构象的柔性等。

应用工程内含肽来环化蛋白质，即应用细菌表达系统生产环化蛋白，这种方法开辟 了改进蛋白质稳定性的途径。这种环化方法通过蛋白剪接反应实现的，从蛋白前体上释 放一个内部的蛋白序列，称为内含肽。在内部蛋白序列的剪接过程中，内含肽被包埋蛋 白前体中，催化自身的剪切，进而把两侧的蛋白序列连接起来。将目的的蛋白融合表达 在内含肽的两部分中，形成一个三明治结构。当内含肽被释放时，目的蛋白的C、N端处 形成一个肽键，使目的蛋白环化起来，蛋白质的稳定性将会提高。

发明内容

本发明的总的目的是开发一种新的酶蛋白环化技术，提供具有热稳定性及蛋白酶抗 性的环化酶。

本发明的另一目的是提供在细菌表达系统中高效表达生产环化酶的方法。

技术解决方案

本发明提供了一种环化的酶，其特征在于，其多肽序列的前5个氨基酸具有SEQ ID NO：1序列，最后5个氨基酸具有SEQ ID NO：2序列；且酶蛋白的N、C两端相链接。

所述环化的酶蛋白的N、C两端相链接，是通过内含肽介导的环化方法，用天然的 肽键将酶蛋白的N、C两端链接起来。

在本发明的一个实例中，对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的中性植酸酶基因 PhyC进行环化，编码该环化植酸酶的基因具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。经实 验证实，环化后的植酸酶的热稳定性和蛋白酶的抗性均有所提高。

本发明还提供了一种环化酶蛋白的方法，包括整套表达载体的构建、重组字的筛选 及环化分子的鉴定方法，将前5个氨基酸具有SEQ ID NO：1序列，最后5个氨基酸具有 SEQ ID NO：2序列的编码基因在大肠杆菌中的环化表达。

所述环化酶蛋白的方法是利用天然集胞蓝细菌(Synechocystis species PCC6803) Ssp DnaE内含肽的转剪接特性，分别于体内体外对蛋白质环化。

在本发明的一个实例中，所述酶蛋白是植酸酶蛋白，环化方法是将SEQ ID NO：3所 示核苷酸序列的基因在大肠杆菌中的环化表达，通过内含肽的转剪接作用环化中性植酸 酶PhyC，所述Ssp DnaE内含肽的基因具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。具体方 法如下：

1.环化载体构建按常规方法克隆(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。从集胞蓝细菌(Synechocystis species PCC6803)的dnaE基因中PCR， 分别得到Ssp DnaE内含肽的N端和C端2部分，后连入pMXB10载体，形成表达载体pEB1。

2.基因克隆从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组中PCR得到一个中 性植酸酶基因phyC，克隆到上述表达载体pEB1中。转化到大肠杆菌，获得重组子。

3.蛋白的表达和纯化加入IPTG诱导表达PhyC植酸酶，通过镍柱亲和纯化体内 生成的环形植酸酶；通过几丁质亲和柱得到体外的环形植酸酶。验证蛋白的环化情况。

用本发明的方法改良的植酸酶具有更好的热稳定性。本方法为体内环型植酸酶的生 产奠定了基础。

附图说明

图1为大肠杆菌重组载体pPEB的物理图谱；

图2为大肠杆菌重组载体pEB1的物理图谱；