[发明专利]利用牛体细胞核移植克隆胚胎的方法

说明书

技术领域

本发明涉及哺乳动物繁殖技术领域，具体涉及一种利用利用牛体细胞核移植克隆胚胎的方法。

背景技术

体细胞核移植在20世纪末期出现了突破性进展，自从多莉羊诞生之后，越来越多的体细胞克隆动物降生，体细胞核移植的重要意义逐步得到人们的认可。但是该技术构建的重构胚的发育率低，而在制作重构胚的技术中，供核细胞的前处理以及显微注核去核操作是关键的限制步骤。

目前人们对供核细胞的前处理主要有血清饥饿法(Campbell et al.，1996)和接触抑制法(Kasinathan et al.，2001)，以期达到细胞同期化的目的。还有人认为传代次数(王玉阁等，1999)对核移植的效果也有影响。此外还有一些其它特殊处理(Sullivan etal.，2004)的报道。但是各种方法是否有显著的效果尚无定论。

在卵母细胞的去核方法上，目前的主流方法是盲吸法，盲吸法以第一极体为参照进行去核，又包括吸引除核法(McGrath Jet al.Science，1983，220：1300)和挤压除核法(Shiga etal.，1999)两种方法。去核方法还有(王振飞等，2006)和手工克隆法(Peura et al.，1998)。这三种方法各有利弊，盲吸法没有对卵母细胞的化学性损伤，但是第一极体与核的位置随着卵母细胞的成熟会发生偏移，因此去核率不太高，卵母细胞胞质损失较多。去透明带核移植法操作较为繁琐，而且其实验步骤中也有染色及紫外照射的过程，同样会对细胞有伤害。在构建克隆胚哪种方法最佳上至今无统一观点。

在重构胚的构建上主要有电融合法(Wilmut et al.，1997)和胞质内注射法(Wakayamaet al.，1998)两种。“多莉”就是使用电融合法构建的。然而，上述方法所面临着共同的难题是效率低下、过程繁琐。显微镜下的操作环境是不利于细胞生存的，操作时间过长可能对胚胎发育有害。由于显微操作对仪器设备要求高并且技术性强，因此操作人员的熟练程度也是一个制约因素，培养一名熟练的实验人员也需要很长的时间，所以当前亟待解决的一个难题就是发明一种简单、高效的核移植方法，以利于核移植技术在更广范围的推广与应用。

胞质内直接注射法是由精子胞质内直接注射法(ICSI：intracytopasmic sperminjection)发展而来(Collas and Barnes，1994)。胞质内注射的关键是注核以前的破膜处理以使供体细胞的质膜破裂。直接注核法主要分为两种方式：Piezo驱动装置辅助的直接注核和普通显微操作系统辅助的直接注核(Wolf et al.，1998；Fulka et al.，1998；Heymanet al.，1998；Campbell et al.，2007)。

胞质内直接注射法是将供体破膜后，借助Piezo驱动注射装置将核胞体直接注入到受体胞质中，研究人员采用此种方法以成功获得克隆小鼠(Wakayama et al.，1998)、克隆猪。后者则不需要该装置，用普通的显微操作系统即可实现复杂的胞质内直接注射。为了进一步简化核移植操作过程，一些研究人员尝试利用未进行破膜处理的供体细胞进行全细胞直接注射核移植，从而避开了核的分离和电融合的过程，该种方法也成功获得克隆亚洲黄羊后代(Lee et al.，2005；Chen et al.，2007；Zhou et al.，2000)。胞质内全细胞直接注射法大大简化了核移植操作流程，降低了对SCNT对操作人员和试验设备的要求为该技术的推广应用奠定了基础。有关胞质内注射法研究的进展情况见表1。

表1体细胞克隆发展过程中重大里程碑

迄今为止，尚未见有关利用不经血清饥饿和破膜处理的供体细胞做供体，采用全细胞直接注射法生产牛克隆胚胎的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，利用利用牛卵母细胞去核，利用核移植方法获得牛胚胎克隆的方法。本发明在供体细胞培养方面尽量简化不必要的步骤，在去核操作中改进了现有的盲吸法去核，采用全细胞直接注射法成功的获得了牛克隆囊胚。本发明经过大量重复试验已经证明了该方法简便、快速、有效和和稳定，能够获得比较理想的囊胚率，对于其他哺乳动物的核移植有一定参考和借鉴意义。

本发明是这样实现的：