[发明专利]利用牛体细胞核移植克隆胚胎的方法

权利要求书

1.一种获得牛克隆胚胎的方法，其步骤包括：

1)取牛卵母细胞在成熟培养液中培养；2)将牛供体细胞注入受体卵母细胞中，获得重构卵母细胞；3)将步骤2)的重构卵母细胞激活，获得重构胚，其特征在于，步骤2)中的牛供体细胞为牛卵丘细胞或颗粒细胞，且不经过破膜处理；将取出的牛卵母细胞置改良的成熟培养液中培养22h，培养温度为39℃，使所述的牛卵母细胞处于第二次减数分裂中期，去除成熟卵母细胞的细胞核，获得牛受体细胞；采用全细胞直接注射法将牛供体细胞注入所述的牛受体细胞中，获得牛重构胚；然后将所述牛重构胚置于改良的成熟培养液的微滴中培养3-4h，进而将所述的牛胚胎暴露于激活培养基-1中激活5min，然后转移到激活培养基-2中激活3-4h，将激活的牛重构胚在胚胎培养液中培养7天，培养过程中采用同卵母细胞同源的卵丘细胞单层共培养，

其中：

改良的成熟培养液配比如下：

以TCM-199商品液体培养基为基本培养基，附加胎牛血清10％，乙基哌嗪乙磺酸25mM，丙酮酸钠0.55mg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL，促卵泡素0.1IU/mL、促黄体素0.1IU/mL、雌激素1ug/mL、表皮生长因子100ng/mL，pH 7.0-7.2；

激活培养基-1配比如下：

基础液为改良的成熟培养液+离子霉素5μmol/L，pH 7.0-7.2；激活培养基-2配比如下：

基础液为改良的成熟培养液+二甲基氨基嘌呤2mmol/L，pH 7.0-7.2；胚胎培养液配比如下：

氯化钠107.63mmol/L+氯化钾7.16mmol/L+磷酸二氢钾1.19mmol/L+硫酸镁1.51mmol/L+青霉素钠0.012g/L+硫酸链霉素50μg/L+乳酸钠5.35mmol/L+碳酸氢钠25.00mmol/L+丙酮酸钠7.27mmol/L+氯化钙1.78mmol/L+肌醇2.77mmol/L+酚红10.0μg/mL+枸杞酸钠0.34mmol/L+必需氨基酸30.0μl/ml+非必需氨基酸10μl/mL+L-谷氨酰胺0.20mmol/L+BSA3mg/mL，pH 7.0-7.2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的牛供体细胞不经过血清饥饿和体外培养。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在牛重构胚培养第一天不添加胎牛血清，从体外培养的第二天开始添加10％体积的胎牛血清。