[发明专利]一种在氨基磁珠表面共价偶联蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明属于磁性材料技术领域，特别提供了一种在氨基磁珠表面高效率共价偶联蛋白质的方法。偶联蛋白质的磁珠可用于免疫检测、细胞分选等。

背景技术

磁珠，又称磁性微粒或磁性颗粒，是一类直径在纳米或微米级的球形复合材料。磁珠的核心由四氧化三铁或三氧化二铁等超顺磁性材料构成，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖等高分子材料。核心物质赋予磁珠超顺磁性，使磁珠可以在外加磁场作用下向磁场方向移动达到分离的目的；外围高分子材料可以通过物理或化学的方法活化产生氨基(NH2-)、羧基(COOH-)或羟基(OH-)等集团，可以被利用与蛋白质或核酸等生物活性分子偶联。偶联后磁珠广泛用于蛋白质分离纯化、细胞分选、微生物分离和核酸分离等领域。

氨基磁珠，即表面含有氨基集团的磁珠，是容易获得的一类磁珠。目前氨基磁珠与蛋白质的偶联多采用以戊二醛为偶联剂的方法。戊二醛在其分子两端各有一个醛基，醛基可与氨基(NH2-)发生共价反应。在理想情况下戊二醛的一个醛基与磁珠的氨基反应，另一个与蛋白质氨基反应，将两者偶联。由于戊二醛是单功能集团的生物偶联剂(Homobifunctional Cross-linker)，由它介导的连接反应没有方向性，除了可引起磁珠与蛋白质的偶联外，还可引起蛋白质之间或磁珠之间的接合，因而偶联效率较低，还会引起磁珠自身聚集。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在氨基磁珠表面高效率共价偶联蛋白质的方法，解决戊二醛偶联法偶联效率低和磁珠聚集的问题。

本发明的主要技术方案是利用两种活化剂分别活化磁珠和蛋白质，然后将二者混合进行偶联，包括以下几个步骤：

(1)磁珠的活化：磁珠用磁珠活化缓冲液清洗1～2次后用该缓冲液重悬，加入磁珠活化剂Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)或Sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)。室温混悬反应15分钟。加入甘氨酸缓冲液，室温混悬反应10分钟中止反应。活化后磁珠用偶联缓冲液洗涤3次后，用该溶液重悬后保存于4℃备用(12小时内用于偶联有效)。

(2)蛋白质的活化：蛋白质在4℃条件下用蛋白质活化缓冲液透析过夜(＞12小时)后，加入活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)，室温反应30分钟。加入甘氨酸缓冲液室温反应5分钟终止反应。用SephadexG25色谱柱纯化活化后蛋白质，纯化所用缓冲液为蛋白质活化缓冲液。活化后蛋白质保存于4℃备用(12小时内用于偶联有效)。

(3)偶联：将活化后磁珠与活化后蛋白质混合，室温混悬条件下反应12～16小时。磁分离，保留上清溶液用于偶联效率检测。磁珠用磁珠保存缓冲液洗涤3次后稀释到一定浓度，4℃保存。

(4)检测偶联效率：测量偶联后上清溶液中蛋白浓度并计算蛋白含量，此为未结合蛋白含量。蛋白总量减去未结合蛋白含量除以蛋白总量即为蛋白偶联效率。

(5)检测磁珠偶联效果：用酶联免疫检测原理，利用可与偶联蛋白质特异反应的的生物酶标记分子(如酶标记抗体)为指示剂。偶联后磁珠用磁珠保存缓冲液倍比稀释。稀释后磁珠与指示剂溶液混合，37℃反应10分钟。洗涤磁珠后加入酶催化底物，显色并中止。磁分离，测量上清吸光度值。吸光度值会在磁珠的某一稀释度出现明显下降。该稀释度能反映磁珠偶联效果，稀释度越高偶联效果越好。

上述的磁珠活化缓冲液为0.03M三乙醇胺，3M NaCl，pH7.6缓冲液。

上述的磁珠偶联缓冲液为0.1M三乙醇胺，0.1M NaCl，pH7.0缓冲液

上述的蛋白质活化缓冲液为0.1M三乙醇胺，0.1M NaCl，1mM EDTA，pH8.5缓冲液

上述的蛋白质偶联缓冲液为0.1M三乙醇胺，0.1M NaCl，1mM EDTA，pH7.3缓冲液

上述的磁珠保存清洗缓冲液为0.01M Tris，0.15M NaCl，0.1％w/v BSA，0.1％NaN3，0.001M EDTA pH7.4缓冲液

本发明具有如下优点：