[发明专利]可用于乙型肝炎病毒感染治疗的RNA干扰靶点

说明书

技术领域

本发明一般涉及分子生物学、细胞生物学和基因治疗领域。更具 体地，本发明涉及可用于乙型肝炎病毒感染治疗的RNA干扰(RNAi) 的42个靶点以及应用这些靶点的重组表达载体和应用这些靶点以各 种方式获得的可用于乙型肝炎病毒感染治疗的药物和方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus)感染是全世界最重要的公共 卫生问题之一。HBV感染引起的相关疾病包括急性或慢性乙型肝炎， 及由慢性乙型肝炎进一步发展引发的肝硬化(HC)、肝细胞癌(HCC) 等。HBV感染的范围很广，目前全世界约有4亿HBV感染者，约20亿 人感染过HBV。慢性HBV携带者中有相当一部份发展成为CHB，部分患 者发展成为HC、HCC，每年因为HBV感染而死亡的人数超过100万(Don Ganem等，新英格兰医学，2004年，35卷：1118-1129页)。我国是 HBV感染高发区，HBV感染率约为56.7％，HBV病毒携带率为9.75％， 约1.2亿人长期携带HBV(1992-1995年全国流调)。在各型病毒型肝 炎中，HBV对人类健康的危害最严重。随着HBV疫苗在1982年的问世， HBV的感染率有明显降低，同时抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治 疗取得了一定的进展。然而，由于HBV携带者数量庞大，而且目前的 抗病毒药物尚无法根治HBV感染，因此仍将有大量的HBV携带者面临 可能发展为肝硬化和肝细胞癌的危险。因此，迫切需要发展新的治疗 手段以对付HBV的威胁。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种由双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)介导的细胞内的序列特异性的抑制 基因表达的机制，是1998年在线虫中进行基因表达抑制研究中被首次 提出(FireA等，自然，1998年，391卷：806-811页)。在此之后， 进一步的研究发现RNAi广泛存在于高等哺乳动物以及真菌、拟南芥、 水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等几乎所有的真核生物中，是一种普遍存 在和保守的抑制基因表达的机制，可起到调控基因表达、抗病毒入侵、 抑制转座子活动等作用(Dykxhoorn DM等，自然分子细胞生物学综述， 2003年，4卷：457-467页)。目前RNAi作用的机制已基本阐明：内 源或外源产生的dsRNA分子在细胞质中被属RNA酶III的Dicer切割成 小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。典型的siRNA结构 特征为：5′端磷酸化，3′端呈对称性突出2-3nt并带羟基，长度为 19-23nt的dsRNA。siRNA分子与RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducing silencing complex，RISC)的蛋白复合体进行结合，RISC具有解螺 旋酶和核酸内切酶活性。siRNA分子在复合体中被解聚，其中反义链 与可与之匹配的靶mRNA按碱基配对原则结合，并引导与之结合的RISC 将靶mRNA在与反义链的结合区中部距5′端10nt的位置处酶解，从而 抑制靶基因的表达。目前获得siRNA的方法主要有：可表达小发夹RNA (short hairpin RNA，shRNA)的质粒和重组病毒载体、化学合成方 法、体外转录等。

目前，RNAi技术在包括乙型肝炎病毒感染在内的病毒性疾病以及 肿瘤等疾病的防治研究已显示出良好的应用前景。研究已显示靶向 HBV mRNA的siRNA可在体外培养的人肝癌细胞株中抑制HBV的复制和 病毒基因的表达(Konishi M等，Hepatology，2003年，38卷：842-850 页)。由于HBV的致病机理较为复杂，要达到有效的治疗目的必须能 够高效抑制病毒复制和基因表达。然而，并非所有符合常规设计要求 的RNAi靶点都能够有效抑制靶基因的表达，不同靶点间的抑制效率各 有差别。因此，选择获得合适的具有高抑制效率的RNAi靶点成为RNAi 技术是否能够成功应用于抗HBV治疗的重要因素。选择合适的RNAi 靶点需要从结构特征、抑制效率、非人类基因同源性等方面进行综合 考虑。可使用的辅助方法包括目前已提出的siRNA辅助设计软件、RNA 分子结构分析、核酸序列分析比对以及实验经验等，并通过具体的抑 制评估实验予以验证。