[发明专利]转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术和生物工程技术领域，具体地说，是一种转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用。

背景技术

自80年代起我国开始牙鲆的商品养殖以来，因其市场价值高、经济效益好，其在水产养殖中比重越来越大。到2006年我国牙鲆的养殖产量已超过82560吨，产值突破60亿元，其中，牙鲆和大菱鲆是目前我国鲽科水产养殖中最重要的种类，近年来又引进了大西洋夏鲆、漠斑牙鲆、塞内加尔鳎等，牙鲆的人工养殖规模日益扩大。但是在牙鲆较长的养殖过程中，由于温度、水质等原因的影响，容易导致其生病死亡，造成经济损失。因此通过现代化生物技术手段改善鲆鲽鱼的生长速度，降低养殖成本及风险，成为业内人士共同关注的焦点。

鱼类生长激素(GH)是由鱼的脑垂体前叶细胞合成分泌的一种单链多肽类激素。在硬骨鱼中，生长激素的促生长作用主要是作为新陈代谢的调控元件，促进脂肪更多地分解作为能源，使吸收的氨基酸更多地用于生长；提高饵料中蛋白质的转化效率，促进蛋白质的合成；对糖类代谢的影响表现为可促进肝糖原的消耗，增强对碳水化合物的利用能力。生长激素在鱼体内的多层次上的调节功能，可以有效地促进鱼体的生长、发育。

正常鱼体内生长激素含量甚微，每升鱼血仅含20μg，从鱼体中提取是不可能的。为满足海水鱼养殖业的需要，运用基因工程技术，利用微生物发酵生产成为大量获得廉价鱼生长激素的一条有效途径。许多研究证实，基因工程方法获得的生长激素具有代偿内源生长激素的功能，肌肉注射外源生长激素，可促进鱼体生长；饵料中添加的生长激素可通过鱼体消化道后肠上皮细胞的胞饮作用吸收，提高鱼体的生长速度，而且在鱼体内半衰期一般在6h以内，在12--24h之后，基本检测不到。而且由于大多数海水鱼类的生长激素有较高的同源性，一种海水鱼的生长激素对其它海水鱼也有促进生长的作用，所以其应用范围较广。

现有技术中，有两类方法推动着鱼类生长激素基因体外表达向应用发展：

其一是表达效率的提高，根据大肠杆菌偏爱密码子和已知鱼的生长激素氨基酸序列，人工合成生长激素cDNA，转化大肠杆菌，获得大量的生长激素；或者构建新型表达载体，在大肠杆菌中高效表达，获得更高表达量的外源蛋白。然而大肠杆菌的表达产物往往形成包涵体，对其处理耗时、繁琐，同时表达粗提物中含有内毒素，必须对目的产物进行严格的分离纯化才可应用。因此人们又转而尝试可作为饵料的表达系统。

酿酒酵母基因工程菌不仅具有原核系统的优点，而且具有典型真核系统的特性，被认为是表达外源蛋白的合适寄主。其优越性表现在：1、具有类似原核生物生长快，容易培养，繁殖速度快，能高密度培养，易于遗传操作的特点；2、具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程；3、采用高表达的启动子，高效表达目的基因，可诱导调控；4、完成基因组测序，具有完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力；5、酿酒酵母安全无毒。加之酿酒酵母细胞内有着较其他生物更为高效的同源重组修复机制，研究表明30-50bp的同源区段就可以介导有效的重组，这使得酿酒酵母比其它生物更合适应用同源重组技术进行各种DNA操作，从而实现外源基因在酿酒酵母中的长期稳定表达，已经有多种药物—如纤维二糖酶、人α干扰素、乙肝表面抗原等在酿酒酵母中得到了表达。

目前已发展和建立的酿酒酵母表达载体既有整合型载体又有附加体型酵母。应用于酿酒酵母的附加体型表达载体多为大肠杆菌—酿酒酵母穿梭表达质粒，此载体可在细菌宿主中进行选择和增殖，常使用pUC质粒的复制起点和氨苄青霉素抗性选择标记。酵母部分通常包括酵母的2μm质粒的复制区，用于酵母转化的选择元件主要是营养缺陷型相关的基因。这类载体能独立于酵母染色体之外复制，常以30或更多拷贝存在，但没有选择压力时不稳定。这种类型表达载体在细胞中必须有选择压力才能稳定表达，不适于工业化生产。另一类载体没有在酵母中复制的质粒复制区，而是利用同源片断将载体整合到染色体上，这类染色体稳定性高，适于工业化生产，但拷贝数低。在表达时，外源基因与来自酿酒酵母的高效表达基因启动融合，这些启动子既有组成型表达，也有诱导型表达。