[发明专利]转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于：所述的转基因酵母是将牙鲆生长激素基因转入酿酒酵母中获得的。

2.根据权利要求1所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于：所述的转基因酵母表达牙鲆生长激素，该转基因酵母已由中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为：CGMCC No.2478。

3.根据权利要求1所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于：所述的酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae色氨酸合成缺陷型。

4.根据权利要求1或2所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于：所述牙鲆生长激素基因为牙鲆生长激素成熟肽cDNA，含有525bp的核苷酸片段，与序列表第1号序列所示核苷酸序列具有100％的同源性。

5.根据权利要求2所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于：所述转基因酵母表达的牙鲆生长激素为牙鲆生长激素成熟肽，编码174个氨基酸残基，其分子量为19KDa，其氨基酸序列与序列表第2号序列所示的氨基酸序列具有100％的同源性。

6.根据权利要求4所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于：所述的牙鲆生长激素基因转入酿酒酵母中是通过将牙鲆生长激素基因构建载体pIPGK-GH，转化酿酒酵母，获得转基因酵母Saccharomyces cerevisiae YGH。

7.根据权利要求6所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于：所述的载体pIPGK-GH中，牙鲆生长激素cDNA的前端为酿酒酵母的PGK(磷酸甘油激酶基因)的启动子，由PGK启动子来启动牙鲆生长激素的表达，PGK启动子长1490bp，与序列表第3号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性。

8.根据权利要求6所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于：所述的载体pIPGK-GH中，生长激素基因表达框的两侧为酿酒酵母的URA3基因，以URA3基因作为与酿酒酵母的基因组DNA发生同源重组的位点，URA3基因长807bp，与序列表第4号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性。

9.根据权利要求1所述的转牙鲆生长激素基因酵母的制备方法，其特征在于具有如下步骤：

[1]牙鲆生长激素cDNA的制备：

提取牙鲆脑垂体总RNA，设计含有酶切位点BamH I和Not I的引物ping1和ping2，ping1引物序列与序列表第5号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性，ping2引物序列与序列表第6号序列所示的核苷酸序列具有100％的同源性，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，扩增出生长激素成熟肽cDNA，测序确定其与预期的序列一致；

[2]构建酿酒酵母转化载体：

将牙鲆生长激素成熟肽cDNA，经BamH I和Not I双酶切后连入大肠杆菌质粒pUC-PGK，构建转化载体pIPGK-GH，大肠杆菌质粒pUC-PGK是以pUC18为原始载体，在其多克隆位点中依次连入URA3基因上游序列、PGK启动子序列、色氨酸基因序列和URA3基因下游序列构建而成的，测序确定生长激素cDNA序列、PGK启动子序列和URA3序列均与预期的序列一致；

[3]牙鲆生长激素基因转化到酿酒酵母中：

转化载体pIPGK-GH经Nco I酶切后回收获得含牙鲆生长激素基因的线性片段，该线性片段通过LiAc介导的方法转化酵母感受态细胞，然后将转化的酿酒酵母细胞涂布在色氨酸缺陷型选择培养基上；

对色氨酸缺陷型选择培养基上长出的阳性克隆进行PCR鉴定，将筛选出的含有生长激素基因的酿酒酵母在YPD培养基上连续传代，挑选生长激素基因稳定存在的酿酒酵母单克隆进行大规模培养；

[4]转牙鲆生长激素基因酵母的培养：

转牙鲆生长激素基因酵母于20-30℃下在YPD液体培养基中震荡或发酵培养，YPD培养基配方如下：

                                   

组分               用量(g/L)

                                   

酵母提取物        10

蛋白胨            20

葡萄糖            20

                                   

10.转牙鲆生长激素基因酵母在养殖鲆鲽鱼类的饲料添加剂或饲料中的应用。