[发明专利]一种利用里氏木霉纤维素酶制备壳寡糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用里氏木霉纤维素酶制备壳寡糖的方法。

背景技术

低聚糖也叫寡糖，过去把双糖到十糖称之为寡糖，现在一般把这个范围扩大到二十糖，称作低聚糖。低聚甲壳素可叫甲壳寡糖，低聚壳聚糖可叫壳寡糖。对于甲壳素和壳聚糖来说，相对分子量低于10000的壳聚糖，具有许多优于高分子量壳聚糖的功能，尤其是具有生物活性的甲壳素和壳聚糖的五-九糖，特别是六糖和七糖在抑制肿瘤方面的作用令人鼓舞，是当今国内外研究、开发的重点领域。

低聚壳聚糖和低聚甲壳素的制备，大体有3类方法：酸水解法、氧化法和酶解法。酸水解法有盐酸法、乙酸法、磷酸法和氢氟酸法；氧化法包括过氧化氢法、过硼酸钠法和次氯酸钠法；酶解法可分为专一性酶降解法和非专一性酶降解法两种。

尽管用化学和物理降解也能得到低聚壳聚糖，但这些方法由于反应条件和分离条件的控制难度大，并且聚合度在6-10的壳聚糖的产率低，降解得到产物的分子量不均一，分布宽，成本高；酶解法由于具有特异性，可选择性地切断特定链，从而制得特定的低聚糖，并且反应条件温和，不采用强酸强碱，避免了寡聚体的破坏，不会造成环境污染，被认为是壳聚糖降解的最理想方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用里氏木霉纤维素酶制备壳寡糖的方法，利用来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶降解壳聚糖。

本发明的目的是这样来实现的，其步骤方法如下：

(1)壳聚糖的纯化：取壳聚糖，先加入少许水溶胀后，再加入1％的乙酸溶液使之充分溶解，进行减压抽滤，弃除杂质(主要是金属粉末)，取其滤液，加入1mol/L的氢氧化钠溶液，使壳聚糖沉淀出来，用水漂洗至中性，减压抽滤干燥后，加200mL无水乙醇，40~50℃水浴加热2小时，放在干燥箱里烘干后，碾成粉末备用。

(2)壳聚糖的酶解：量取一定量的经步骤1纯化的壳聚糖溶液倒入三角瓶中，置于水浴振荡器中至恒温50℃后，再加入相应比例的纤维素酶液，摇晃均匀，转速100r/min，反应结束后立刻取出，煮沸10min使酶灭活，然后减压抽滤移走酶。

(3)降解：在温度50℃、pH5.0、壳聚糖∶酶为5∶1的条件下，酶解1-24h。

(4)丙酮-水分级萃取：壳聚糖水解后的滤液在减压条件下浓缩直到最后体积为初始体积的10％，然后与等体积丙酮混合得到沉淀，在4000转/分离心30分钟收集该沉淀，使用50％丙酮洗脱几次，然后在真空干燥箱中干燥，得A部分。剩余的溶液在减压蒸馏下浓缩到约原体积的5％，然后加入9体积丙酮使之充分混合产生沉淀，离心收集形成的沉淀，用90％丙酮洗涤，减压干燥，得B部分。

壳聚糖(Chitosan，)，来源于蟹壳，脱乙酰度＞80％，表观粘度333mPa·s(2％壳聚糖溶液，乙酸浓度1％，用旋转粘度计测定)，购于青岛海生生物工程有限公司；

纤维素酶(Cellulase)，由里氏木霉发酵培养并经纯化而得的酶粉。

分子量是根据特性粘度法推算，使用乌氏粘度计(上海玻璃仪器一厂)测特性粘度，用NDJ-9S型数显粘度计(上海精密科学仪器有限公司)测定表观粘度，两种粘度的测定温度为25度；采用基质辅助激光去离子时间飞行(MALDI-TOF MS，Bruker，American)分析水解产物及其分级沉淀产物。

在本发明中使用的壳聚糖是从甲壳类的外壳中提取的甲壳质经酸碱处理后得到的产物，例如利用水产加工的废弃物，能够降低成本。

本发明的优点是：反应条件温和，不采用强酸强碱，避免了寡聚体的破坏，不会造成环境污染，是壳聚糖降解的理想方法。

具体实施方式

实施例1 在温度50℃、pH5.0、壳聚糖∶酶为5∶1的条件下，分别酶解1h、4h、8h、24h，测特性粘度，算出分子量。结果表明：随着壳聚糖与酶的比值增大和反应时间的延长，壳聚糖的平均分子量分别降解到32949、9770、3831和1848，降解效果明显增强。

实施例2 同实施例1步骤，酶解28hr，壳聚糖酶解后的滤液在减压条件下浓缩直到最后体积为初始体积的10％，然后与等体积丙酮混合得到沉淀，在4000转/分离心30分钟收集该沉淀，使用50％丙酮洗脱几次，然后在真空干燥箱中干燥，得A部分(平均分子量约为1200)。剩余的溶液在减压蒸馏下浓缩到约原体积的5％，然后加入9体积丙酮使之充分混合产生沉淀，离心收集形成的沉淀，用90％丙酮洗涤，减压干燥，得B部分(平均分子量约为650)。