[发明专利]含有生物标志物样本的高通量分析方法和样本库制备

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体地，本发明涉及一种对于包含生物 标志物的样本进行高通量分析的方法；本发明还涉及一种用于高通量分析的 矩阵化排列样本的样本库的方法；本发明同时涉及根据本发明所述方法所制 备的样本库。

背景技术

对生物组织来源的具有一定生物学意义的生物标志物以适当形式进行 分析，是生物医学研究中的一项重要命题。这种生物标志物分子是指包括但 不限于：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或cDNA、蛋白、多肽、 脂质、多糖，通常要求以其相应生物医学属性，如分子量、所带电荷来进行 分离组份化，以进行更有价值和准确的分析。

生物标志物分子的分离或组份化是由相关生物标志物分子所具有的一种 或多种属性而决定的、能够使其与其他成分分子相分离的方法，包括琼脂糖 电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、双向PAGE、等离子聚焦、离子交换 色谱、过滤色谱、疏水色谱、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、 气相色谱、原子吸收、亲合色谱、梯度离心。经生物标志物分离组份化的方 法处理，生物标志物分子(群)以其本身属性与其他分子相区分，这些属性 包括：分子量大小、电荷、有机相溶解性、亲合性、质量、形状、密度或颜 色。

例如，传统的RNA印迹技术(Northern blot)和蛋白免疫印迹技术 (Western blot)是广泛应用于分析样品中RNA和蛋白生物标志物分子大小 或含量的主要方法。Northern blot(对于RNA分子的分析)和Western blot (对于蛋白分子的分析)由Southern blot(对于DNA分子的分析)演化而 来(Southern，E.M.1975.Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.J.Mol.Biol.98：503-517，此处作为文献引用)， 对一部分细胞或者组织而言这两种方法是检测分析生物标志物基因转录、 表达翻译的分子量和表达水平的必备检测方法。

尽管例如差异显示、RT-PCR或RNA保护检测(RPA)也适用于此种检测， 但Northern blot分析和Western blot分析是对于特定生物标志物基因和特 定生物标志物蛋白分子量及表达水平的最佳检测方法。其它的检测方法由于 步骤复杂或引入酶的操作等而变得使用不便或者不通用。与其他方法比较， Northern blot分析和Western blot分析是对生物标志物基因和蛋白的实际情 况的最好检测方法，这两种方法在确定备选的生物标志物的断裂基因的大 小、生物标志物蛋白翻译后修饰、以及生物标志物基因和蛋白表达水平等方 面都是必不可少的重要手段。

Northern blot和Western blot方法使用多年，其具体操作仍同多年前一 致。在进行Northern blot时，对RNA生物标志物的琼脂糖电泳使用变性剂 诸如甲醛和甲醛胺，因为RNA分子群每分子携带一单位负电子，RNA生物 标志物在琼脂糖中的迁移速度取决于其核酸长度和分子大小。

凝胶上组份化的RNA核酸生物标志物可以被点样于尼龙或者硝酸纤维 膜上制成Northern blot。在Northern blot分析中，可以加入带有标记核苷酸 和靶核苷酸互补片段的探针对特定RNA生物标志物片段进行杂交探测。 Northern blot可以同时进行RNA生物标志物定量并测定其分子大小。

Western blot与Northern blot方法的不同是由于蛋白质生物标志物与 RNA生物标志物的根本性质不同。蛋白质依照其不同的氨基酸构成可以携 带负电荷或者正电荷。

为了得到基于分子量的整齐一致的梯度或系列排列的组份化蛋白分子 标志物，在蛋白上样缓冲液和其电泳凝胶中加入了十二烷基硫酸钠(SDS)，二 硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇。SDS是阴离子去垢剂，以特定的1.4∶1 质量比同蛋白质结合，其所携带的负离子电荷数同蛋白片段的长度成正比。 所有的蛋白分子同SDS结合后，整齐一致地携带负电荷，另外还原剂如二 硫苏糖醇(DTT)和β-mecarptoethanol(β-巯基乙醇)可以打断蛋白质二硫键， 以避免蛋白质的高级结构影响凝胶电泳。