[发明专利]微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因快速检测方法，具体利用环介导等温扩增(LAMP)技术与纳米硫化铅标记基因序列电化学分析技术联用检测转基因大豆外源基因(CP4 EPSPS)的方法——微孔板固定与纳米硫化铝标记电化学检测转基因大豆的方法。

背景技术

近年来，转基因植物在全球的种植面积迅速增长，主导的转基因大豆占据全球转基因作物的63％以上，所有的转基因大豆均为抗除草剂大豆，也就是抗草甘膦转基因大豆。该品系大豆的外源蛋白为CP4EPSPS，可以有效的降解除草剂草甘膦，而经动物实验证实对人畜无害。在中国的转基因检测的国家标准中，确定把检测CP4 EPSPS基因列为筛选基因。但是现有的检测方法都是基于或利用复杂的PCR或者荧光PCR技术的，没有使用环介导等温扩增技术检测CP4 EPSPS基因的，也没有使用环介导等温扩增技术与纳米标记电化学分析技术联用检测CP4 EPSPS基因的报导。现有的方法存在检测成本高、耗时长等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供纳米硫化铅标记寡核苷酸序列微孔板杂交电化学分析与环介导等温扩增联用检测转基因大豆外源基因CP4 EPSPS的方法微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆，以克服现有技术的上述缺点，从而为转基因产品的检测提供简单易行的方法。

本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10⁹拷贝。LAMP等温扩增的产物在微孔板上固定后与纳米硫化铝标记的探针序列发生分子杂交反应而结合，利用强酸将杂交双链DNA上纳米粒子溶解后采用高灵敏的电化学分析方法测定溶解的金属离子，产生的电化学分析信号与LAMP等温扩增产物相关，进而达到对检测转基因大豆外源基因(CP4 EPSPS)的电化学检测的目的。

本发明涉及的环介导等温扩增连用检测转基因大豆，扩增DNA在聚苯乙烯微孔板固定，纳米硫化铅标记寡核苷酸序列电化学分析的方法，其中的试剂包括如下(1)-(4)：

(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液：

包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

其中，上游内引物5-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3、

下游内引物5-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3、

上游外引物5-CCATGGGCGCCAGGAT-3、

下游外引物5-ATCGGGCGCTTTGTGAG-3；

(2)Bst DNA聚合酶：8U/μL；

上面所述环介导等温扩增反应液每管23μL的最佳组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL10mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/LMgSO₄、12.5μL 2M甜菜碱和4μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

(3)转基因大豆外源基因CP4 EPSPS探针序列的纳米硫化铅(PbS)-探针序列标记液，其制备方法如下：