[发明专利]微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆的方法

权利要求书

1.一种微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：环介导等温扩增反应扩增品系为GTS 40-3-2的转基因大豆外源基因CP4EPSPS，得到外源基因CP4EPSPS的双链目标序列扩增产物，将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，然后将纳米硫化铅对来源于外源基因CP4EPSPS的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与固定在微孔板上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的电化学测定，且环介导等温扩增反应中的试剂包括：

(1)环介导等温扩增反应液：

包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中：

上游内引物：5-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGAC ACC-3、

下游内引物：5-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3、

上游外引：5-CCATGGGCGCCAGGAT-3、

下游外引物：5-ATCGGGCGCTTTGTGAG-3。

(2)Bst DNA聚合酶：8U/μL。

2.根据权利要求1中所述的微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆的方法，其特征是上述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

3.根据权利要求1中所述的微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆，其特征是环介导等温扩增反应依次包括下列步骤：

(1)待检样品DNA的提取：

提取样品核酸，即提取待检样品DNA作为环介导等温扩增反应的模板，其中提取样品DNA的光密度值OD_260/280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL之内；

(2)进行环介导等温扩增反应：

A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL待检样品模板DNA，恒温50℃放置3min后于恒温95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；

B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；

C.于恒温60-65℃放置45-90min；

D.将温度调到80-95℃，反应3-5min后中止反应得到环介导等温扩增反应的待测外源基因CP4EPSPS的双链目标序列的扩增产物，取出待用。

4.如权利要求1中所述的微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆，其特征是上述的双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，其步骤如下：

首先将待测外源基因CP4EPSPS的双链目标序列的扩增产物在100℃水浴中煮沸10分钟，然后在冰浴中快速冷却得到待测外源基因CP4EPSPS的单链目标序列，取100μL该单链目标序列目标序列的溶液至微孔板中，37℃孵育过夜，再于60℃干燥箱中0.5-1.5h蒸干，用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液清洗除去未固定的单链目标序列，即得到固定了待测外源基因CP4EPSPS的单链目标序列的微孔板。