[发明专利]转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术与纳米标记电化学DNA传感器技术联用检测转基因外源基因——新霉素磷酸转移酶(NPT II)的方法，即转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法。

背景技术

磷酸转移酶（Neomycin Phosphotransferase II，NPT II)基因是迄今植物遗传转化中应用最为广泛的选择标记。该基因编码新霉素磷酸转移酶亦称氨基糖苷-3′-磷酸转移酶(aminoglycoside-3′-phosphotransferaseII)，其编码产物可使氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside angibi-otics)如卡那霉素(kanamycin，Km)、新霉素(neomycin)、G418等磷酸化而失活。卡那霉素等氨基糖苷类抗生素能与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S小亚基相结合，影响70S起始复合物的形成，干扰叶绿体及线粒体的蛋白质合成，从而导致植物细胞死亡。NPT II基因在转基因玉米、转基因番茄、转基因马铃薯、转基因油菜中广泛应用，中国国家标准中把可以NPT II基因作为转基因检测的筛选基因。但是现有的检测方法都是基于PCR或者荧光PCR的，没有使用环介导等温扩增技术检测NPT II基因的，也没有报道使用环介导等温扩增技术与纳米标记电化学DNA传感器技术联用检测NPT II基因的报导，且现有的方法存在检测成本高、耗时长等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供纳米硫化铅标记电化学DNA传感技术与环介导等温扩增联用检测NPT II基因的方法，以克服现有技术的缺点，从而为转基因产品的检测提供简单灵敏的方法。

本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识另靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10⁹拷贝。扩增的产物与纳米粒子标记DNA探针电化学传感器相结合，通过电极表面的分子杂交和高灵敏度的电化学测定，从而把扩增产物的多少转化为电信号的测定结果。

本发明的检测方法包括以下步骤：首先进行环介导等温扩增得到扩增反应物-新霉素磷酸转移酶基因的双链目标序列、再将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在金电极表面自组装固定，即得到新霉素磷酸转移酶基因的目标序列修饰电极、然后将纳米硫化铅对来源于新霉素磷酸转移酶基因的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与目标序列修饰电极上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出法的电化学测定，且环介导等温扩增反应中有：

(1)环介导等温扩增反应液：

包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱，1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

其中，上游内引物：

5-CTGATAGCGGTCCGCCACACGGAAAATGGCCGCTTTTCTG-3、

下游内引物：

5-ACATAGCGTTGGCTACCCGTGAGCGATACCGTAAAGCACGAG-3、

上游外引物：5-TGCTTGCCGAATATCATGGT-3、

下游外引物：5-CGATAGAAGGCGATGCGC-3；

(2)BstDNA聚合酶：8U/μL。

上述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。