[发明专利]转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法

权利要求书

1.一种转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法，其特征在于该方法有以下步骤：环介导等温扩增反应得到扩增反应物-新霉素磷酸转移酶基因的双链目标序列、以及将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在金电极表面自组装固定，即得到新霉素磷酸转移酶基因的单链目标序列修饰电极、然后将纳米硫化铅对来源于新霉素磷酸转移酶基因的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与目标序列修饰电极上的目标序列进行分子杂交并进行阳极溶出法的电化学测定，所得电化学信号即为电化学检测转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的依据，且其中环介导等温扩增反应中有：

(1)环介导等温扩增反应液：

包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱，1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

其中，上游内引物：

5-CTGATAGCGGTCCGCCACACGGAAAATGGCCGCTTTTCTG-3、

下游内引物：

5-ACATAGCGTTGGCTACCCGTGAGCGATACCGTAAAGCACGAG-3、

上游外引物：5-TGCTTGCCGAATATCATGGT-3、

下游外引物：5-CGATAGAAGGCGATGCGC-3；

(2)Bst DNA聚合酶：8U/μL。

2.如权利要求1中所述的转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法，其特征是上述的dNTP  内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

3.如权利要求1中所述的转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法，其特征是上述的环介导等温扩增反应依次包括下列步骤：

(1)待检样品DNA的提取：

提取待检样品DNA作为环介导等温扩增反应的模板，其中提取样品DNA的光密度值OD_260/280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL之内；

(2)进行环介导等温扩增反应：

A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL上述的待检样品模板DNA，恒温50℃放置3min后于于恒温95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；

B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；

C.于恒温60-65℃放置45-90min；

D.将温度调到80-95℃，反应3-5min后中止反应得到新霉素磷酸转移酶基因双链目标序列扩增产物的双链目标序列，取出待用。

4.如权利要求1中所述的转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法，其特征是上述的得到新霉素磷酸转移酶基因双链目标序列扩增产物的双链目标序列在水浴中热解成新霉素磷酸转移酶基因单链目标序列后在金电极表面自组装固定的步骤：

将金电极在体积比为3∶7的30％双氧水和浓硫酸的混合溶液中加热5min，以除去有机杂质；然后将其金电极用0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光，接着依次在丙酮、乙醇、二次蒸馏水中超声洗涤1-4min，使金电极表面成光滑镜面，然后浸入8.0-14.0mmol/L巯基乙酸溶液中，室温下避光组装10-15h，取出后用大量水浸泡冲洗，即得到巯基乙酸自组装膜修饰的金电极；然后将新霉素磷酸转移酶基因双链目标序列扩增产物的双链目标序列在100℃水浴中煮沸10分钟，然后在冰浴中快速冷却得到新霉素磷酸转移酶基因的单链目标序列；将上述巯基乙酸自组装膜修饰的金电极浸入含4.0-6.0mmol/L乙基(3-二甲基氨丙酸)碳二亚胺盐酸盐和8.0mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液中活化30min，然后浸入含有单链目标序列的pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，25℃保存12h，取出电极后用大量磷酸盐缓冲溶液冲洗5min除去未固定的新霉素磷酸转移酶基因的单链目标序列，即得到固定有新霉素磷酸转移酶基因的单链目标序列修饰电极。