[发明专利]一步诱导枣叶片体细胞胚胎的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种一步诱导枣叶片体细胞胚胎的方法。

背景技术

植物体细胞胚发生是指体细胞或生殖细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚发生相类似的途径发育成新个体的形态发生过程。由于它是从体细胞分化而来，故称为体细胞胚胎或胚状体。对体细胞胚胎发生机制的探讨源于1902年Haberlandt提出的植物细胞全能性假说，对体细胞胚胎的真正认识是从1958年Steward等利用胡萝卜根进行单细胞悬浮培养，产生与合子胚相似的结构，并长成完整植株开始的。通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株在高等植物中已经证明是普遍的现象，国内外在裸子植物、双子叶植物、单子叶植物重要科的代表植物中多有报道，已有300多种植物获得过体细胞胚胎。目前，大部分研究资料来源于草本植物，在部分木本植物上也有报道，如针叶树、桦树等。在果树上已有28科，43属，93种(杂种)获得了体细胞胚。

关于枣体细胞胚胎途径诱导再生植株的报道较少，且多以幼胚或子叶为外植体。如最早陈维伦等利用酸枣幼胚的子叶获得胚状体，以后李登科等，程佑发等，郝建平等也是利用幼胚和子叶为外植体获得胚状体。到目前为止，以枣离体叶片为外植体进行培养均以不定芽方式再生，通过体细胞胚胎途径还未见报道。本研究旨在以冬枣离体叶片为外植体进行体细胞胚胎诱导，为建立高效稳定的叶片体细胞胚发生系统奠定坚实基础，这对于利用叶片进行基因工程、遗传转化、品种改良等方面的研究都具有十分重要的意义。

发明内容

本发明建立了枣离体叶片体细胞胚胎诱导技术体系，能保证高效率的获得冬枣叶片的体细胞胚胎，为深入开展枣的基因工程、遗传转化、品种改良等方面的研究提供了一种新的技术平台。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先采用合适的离体叶片剪切方法，再对外植体进行体细胞胚胎的诱导，通过不同培养基成分、不同植物生长调节剂、不同培养环境的调控，筛选出冬枣叶片体细胞胚胎诱导的适宜培养基，获得冬枣离体叶片体细胞胚胎。

本发明的具体内容，即离体诱导冬枣叶片体细胞胚胎的方法如下：

外植体选择与预处理  选取苗龄为15-20天的冬枣组培苗叶片，接种在MS+麦芽糖15～25g/L+琼脂3～5g/L+TDZ 5.0～10.0mg/L+AgNO₃1.0～2.0mg/L的固体培养基上进行暗培养，培养基pH值控制在5.0～6.0左右，环境温度在25～30℃条件下，能够诱导出叶片体细胞胚胎。

培养条件  基本培养基为MS培养基，麦芽糖1.5～2.5％，琼脂0.3％～0.5％，培养基灭菌前pH为5.0～6.0。黑暗环境，温度控制在25～30℃。

外植体接种方法  选取生长健壮、苗龄为15-20天的冬枣组培苗叶片，用已灭菌剪刀垂直叶脉剪切数刀，然后正面向上接种于诱导培养基上。

诱导培养  将剪切好的叶片接种到MS+麦芽糖15～25g/L+琼脂3.0～5.0g/L+TDZ 5.0～10.0mg/L+AgNO₃1.0～2.0mg/L的固体培养基上进行暗培养。诱导15-20天时产生大量淡黄色块状的愈伤组织，诱导20-30天时开始从块状愈伤组织表面逐渐突起成瘤状，分化出胚状体。

本发明专利的有益效果是，通过对冬枣叶片外植体适宜的剪切方法，然后接种到诱导培养基上，不经转换培养基即可获得冬枣叶片体细胞胚胎，首次实现了枣离体叶片的体细胞胚胎再生，并在枣叶片体细胞胚胎发生过程中，将非胚性愈伤诱导、胚性愈伤诱导、体胚分化三个步骤合为一步，即在同一种培养基上实现了愈伤组织和胚状体分化，利用此方法不仅简化了试验步骤、不需要多次更换培养基、节省了人力物力，而且与分步诱导相比缩短了诱导时间。因此，本研究建立的叶片体胚发生体系对枣再生体系的研究具有重要指导意义。

附图说明

图1是冬枣叶片初始接种状态。

图2是冬枣叶片在诱导培养基中暗培养15～20天时产生淡黄色块状的愈伤组织。

图3是冬枣叶片在诱导培养基中暗培养25～35天时从块状愈伤组织表面逐渐分化出胚状体。

图4是冬枣叶片分化出的球形胚。

图5是冬枣叶片分化出的心形胚。

图6是冬枣叶片分化出的子叶胚。

具体实施方式

选取苗龄20天的冬枣组培苗叶片，在无菌操作台用已灭菌剪刀垂直叶脉剪切数刀，然后正面向上接种于接种在MS+麦芽糖15～25g/L+琼脂3.0～5.0g/L+TDZ 5.0～10.0mg/L+AgNO₃1.0～2.0mg/L的固体诱导培养基上进行暗培养，培养基pH值控制在5.0～6.0左右，环境温度在25～30℃条件下，诱导15-20天时产生大量淡黄色块状的愈伤组织，诱导20-30天时开始从块状愈伤组织表面逐渐突起成瘤状，分化出胚状体。分化率为84.9％。