[发明专利]一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法，属转基因植物的分子检测领域。

背景技术

随着植物基因工程技术的发展，将外源基因转入植物中以提高植物的产量、品质、抗逆性或用于某些次生代谢产物的生物反应器等成为可能。转基因植物在现代农业技术中扮演越来越重要的角色。转基因的效果有赖于外源基因在转基因植物中稳定表达。然而，多拷贝重复转基因序列的转基因植物常常使外源基因不能在转基因植物中稳定表达，甚至完全不表达。这是在转基因植物很容易发生的现象。特别是花粉管转基因法是外源基因插入有很大的随机性而更易于产生这种现象。因此，在转基因植物早期筛选中，通过分子检测筛选出已插入外源基因的转基因植物，同时筛选出单拷贝数转基因植物具有重要的理论价值和实践意义。一则可大大减少转基因后期筛选的工作量，二则可提高外源基因的表达水平和获得稳定表达的转基因植株。

检测转基因植物拷贝数最常用且准确的方法是Southern分子杂交法和实时定量PCR法。Southern分子杂交法需要放射性同位素操作的实验室条件，虽然也可用非同位素地高辛做标记，但检测的灵敏度降低，也不能改变长而复杂实验过程。植物种内特异单拷贝数基因常常被用作参照基因来鉴定转基因植物的拷贝数，如棉花的特异单拷贝数基因SADI(Xu et al.，2006)，番茄特异单拷贝数基因液泡转化酶(杜春芳等，2004)，水稻单拷贝基因SPS适于做为转基因水稻PCR检测(Ding et al.，2004)。然而，这种方法是基于实时定量PCR的方法实现的，其实验设备、试剂、耗材都较昂贵。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用普通或梯度PCR循环仪和植物种内特异单拷贝数基因实现转基因植物拷贝数鉴定的简单新方法。PCR产物的多少在琼脂糖电泳图像中所形成产物带的光密度的高低不同，并在一定范围内有线性相关关系，PCR的产物多少与样品模板基因的拷贝数和PCR的循环数有直接相关关系。本方法利用了这一原理，首先将所有待检测样品的DNA浓度调整一致。保证了样品之间的可比性。然后做目标基因和内标基因在事先确定的相同循环数下的平行PCR反应及琼脂糖电泳，最后根据目标基因与内标基因PCR产物在电泳图像中的光密度值的比值来确定目标基因的拷贝数。

本方法与转基因植物的检测紧密结合，并利用其结果。在转基因植物PCR检测的基础上，选取目标基因在电泳图像中最亮带的样品为确定PCR最佳循环数的样品。一般说来不同样品同一基因的PCR，在相同的DNA模版浓度和相同的循环数的条件下，基因的拷贝数多，PCR产物就多。选择目标基因在电泳图像中最亮带的样品有可能在所检测的样品中选择了基因拷贝数多的样品。用这个样品做DNA模板，做系列循环数(20，22，24，……38)条件下的PCR反应及产物电泳，在数字化电泳图像中，随着PCR循环数增加，目标带的光密度值增加，选择目标基因带光密度值出现拐点，内标基因的带也清晰可见的循环数确定为最佳循环数。在PCR循环数拐点以下，会出现一个PCR产物与光密度值之间相关的线性区间，为相对定量计算提供了可能。单拷贝基因样品在这个循环条件下的PCR产物相对较少，其产物在电泳图像中的光密度值会落在这个线性区间内，有利于鉴别。如果PCR循环数高于拐点，PCR产物与光密度值之间就会失去线性关系，难以分辨差异。

当最佳循环数确定之后，做同一样品的目标基因和内标基因在同样循环数下的平行PCR反应。即做同一样品模板的PCR反应混合液，均分成等份后再加入不同的引物，在相同循环数下再做相同循环条件的PCR反应及产物电泳，保证除引物不同之外，PCR反应液、循环数、循环条件(使用梯度PCR循环仪时，两对引物的退火温度可不同)、产物电泳条件均相同。使目标基因和内标基因产物间的系统误差减至最小，使单拷贝的内标基因与待测目标基因的拷贝数达到好的可比性。在电泳图像中，待测目标基因的PCR产物带亮度与内标基因PCR产物带相似，可目测鉴定为单拷贝外源基因插入样品，亮度显著高于内标基因PCR产物的，为多拷贝外源基因插入样品。然而，目测失之准确，我们引入了MATLAB软件的自编程序来完成数字化电泳图像中PCR产物带的光密度值计算。其PCR产物带的光密度值包括了基因扩增带所形成区域的大小和灰度值高低两个因子。将目标基因带与内标基因带的光密度值进行比较，比值接近1∶1的为单拷贝外源基因插入，大于等于2∶1的为多拷贝外源基因插入。