[发明专利]检测水产品食物过敏原基因的实时荧光PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及食物过敏原基因的检测，特别是涉及检一种检测水产品食物过敏原基因的实时荧光聚合酶链式反应(PCR)方法，该方法主要用于鱼类小清蛋白(Par)和甲壳类原肌球蛋白(TM)基因的实时荧光PCR检测。

背景技术

食物过敏医学上也称变态反应。引起食物过敏反应的物质叫做食物过敏原，如鱼、虾、蟹、牛奶、蛋类等。其反应机理为过敏原进入机体以后，会导致机体发生正常或过度免疫应答，即超敏反应。当再次接触相同过敏原时多个IgE分子和抗体结合，引起IgE的Fc端结构改变，导致细胞脱颗粒，释放组胺、5-羟色胺、白三烯等生物呼吸活性物质并作用于效应器官，表现为平滑肌收缩、毛细血管扩张、通透性增加、皮肤过敏、呼吸道过敏、造血系统过敏甚至过敏性休克(赵俊芳，等.食物过敏原检测及其应用前景.中华检验医学杂志，2007，8：948-950)。

近年来食物过敏问题已引起广大消费者、食品生产者和科学研究者的普遍关注。根据流行病学调查，全球约有2％-2.5％的成人受到食物过敏疾病的困扰，婴幼儿的发病率更高，达到4％-6％，儿童约为2％-3％。在联合国粮农组织公布的全球八大类过敏食物中，鱼类和甲壳类水产品是其中重要的两大类，其主要过敏原分别为鱼类小清蛋白(Par)和甲壳类原肌球蛋白(TM)(Food and Agri cultureOrganization.Report of the FAO technical consultation on foodallergies.Rome，Italy.1995.)。

对于食物过敏目前无特别的治疗方法，严格避免接触过敏食物是最有效的方法。常用的检测过敏原方法有体内过敏原点刺试验、体外检测特异性IgE(RAST抑制实验和EAST抑制实验)、双盲食物激发试验和酶联免疫吸附试验等。这些方法中，体内过敏原点刺试验易出现假阳性；RAST抑制实验和EAST抑制实验的不足是对人体血清的依赖性，血清是很难保证一致的，因此该方法难以标准化；双盲食物激发试验易受其它因素影响，实践中也不易操作，实验剂量、安慰剂及双盲控制等环节还有待完善；酶联免疫吸附试验对于微量蛋白难以检测(赵俊芳，等.食物过敏原检测及其应用前景.中华检验医学杂志，2007，8：948-950)。

近年来基因检测方法(如PCR、核酸杂交)以其敏感性高、特异性好、操作简便而倍受检验工作者的青睐。但是常用的PCR检测技术仍需经历一个对扩增产物进行电泳分析的过程，时间耗费在所难免，而且电泳过程中所使用的溴化乙啶染料对人和环境都有不同程度的危害(Lee C Y，et al.Detection of pathogenic bacteria inshellfish using multiplex PCR followed by CovaLink NH microwellplate sandwich hybridization.Journal of Microbiology Methods，2003，53：199-209)。实时荧光PCR的扩增与产物分析全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR检测进行实时监测和自动分析的目标，也从根本上解决了常规PCR可能发生的假阳性污染问题。但目前尚无采用实时荧光PCR方法来检测水产品食物过敏原基因，因此，公众迫切需要将水产品食物过敏原基因检测方法应用于实践。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可定量、快速、灵敏检出水产品食物过敏原的实时荧光PCR方法。

为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：提取样品总RNA，通过SYBR Green或TaqMan探针法实时荧光PCR技术分别检测水产品食物过敏原基因Par和TM，以及内标基因β-actin，依据扩增动力学曲线和Ct值对检样进行结果分析。

本发明具体包括以下步骤：

(1)设计合成用于检测水产品食物过敏原的3组引物及探针。

Par基因的上游引物：5’-ATGGCATTCGCTGGAATTCTG-3’，

Par基因的下游引物：5’-TGCCATTTATGCCTTGACCAG-3’，

Par基因的探针：5’-FAM-AGGGCTGCCAAGCTGCTGACTCC-TAMRA-3’；

TM基因的上游引物，TM-1：5’-CGCATGGACGCCATCAAGAAGAAGATG-3’，

TM基因的上游引物：5’-AGGTTAATAGCCAGACAGTTCGCT-3’，