[发明专利]人参皂甙Rg1对自身免疫性脑脊髓炎小鼠的干预作用

说明书

技术领域

本发明涉及中药单体干预疾病的领域，具体的说是应用人参皂甙Rg1对自身免疫性脑脊髓炎小鼠进行干预，探讨人参皂甙Rg1对多发性硬化的神经免疫机制的干预作用。

背景技术

多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是最常见的神经免疫病之一，在温带发病率可高达3‰。年轻人易患病，发病年龄大约在28岁；具有迁延、复发并逐渐恶化的特点，50％患者在首次发病15年后需借助拐仗行走，致残率高。因此，本病危害性极大。由于MS发病机制迄今不清，目前尚无有效的治疗方法。

MS的治疗主要包括急性发作期的对证治疗和慢性迁延期的预防复发治疗。目前临床上应用于对证治疗的药物主要为免疫抑制剂，如激素、硫唑嘌呤、环磷酰胺和环孢素A等，副作用极大，可引起上消化道出血、无菌性骨坏死、诱发和加重感染、肝、肾功能损害、白细胞下降并影响生育等。而预防复发的药物目前较公认的是β-干扰素(利比)，缓解复发率为60％左右，但长期疗效及安全性评价有待进一步随访研究，且价格昂贵，国内绝大多数老百姓难以承受，因此该药尚未在临床上广为应用。为寻找一种能够从减少复发，减轻发作严重程度及延缓疾病恶化，并适合我国国情(价格适中)的治疗药物，研究人员已更多地将目光投向传统中药制剂以寻求新的治疗手段。

我国传统的中药在治疗免疫病中有其独到的功效，如雷公藤自20世纪80年代以来，便广泛地应用于多种免疫性疾病如类风湿性关节炎及某些肾脏系统免疫性疾病等。但因中药方剂成份较复杂，导致作用机制难以明确、毒副作用难以控制、药物剂量难以规范化，极大限制了其在临床上的推广应用。目前国内外已经分离出许多中药单体，其中部分单体在调节免疫方面功效确切，如雷公藤甲素(Triptolide，Tri)、人参皂甙Rg1在免疫调节、抗炎反应等方面均有独到的作用。人参皂甙Rg1作为人参中有效的活性成份已进行了较多的实验研究。研究发现Rg1具有选择性增强老年鼠的免疫功能，而对健康的青年鼠免疫功能影响不明显，因此认为Rg1是一种免疫调节剂，而不是单纯的免疫增强剂。目前进一步的研究提示人参皂甙Rg1可增强CD4+T细胞活性，抑制Th1特异性细胞因子并上调Th2特异性细胞因子，拮抗Th1细胞作用并促进Th2细胞增殖，从而纠正Th1/Th2细胞的失衡状态。但应用Rg1干预MS的实验研究及临床应用研究目前国内外罕见报道。

发明内容

本发明的目的是基于已经分离出的人参皂甙Rg1中药单体对免疫调节和抗炎作用等方面的作用基础上提出一种应用人参皂甙Rg1干预自身免疫性脑脊髓炎小鼠的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种应用人参皂甙Rg1干预自身免疫性脑脊髓炎小鼠的制备方法的条件建立，其特征是：

1、MOG35-55免疫诱导C57B1/6小鼠，建立EAE模型。

2、应用人参皂甙Rg1对EAE模型小鼠进行干预。

3、对生理盐水对照组和Rg1干预组小鼠进行临床表型的观察。

4、对生理盐水对照组和Rg1干预组小鼠进行病理组织学分析。

本发明的人参皂甙Rg1干预EAE的制备方法：

1、材料：人工合成MOG35-55(序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)肽链片段(该片段是已知的)，不完全弗氏佐剂CFA，热灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MT)，百日咳毒素(pertussis toxin，PT)，人参皂甙Rg1单体，10-12周的C57B1/6小鼠。

2、步骤：

(1)乳化液的制备  按照每只老鼠100微升乳化剂配制，其中含有MOG35-55 300μg，MT 500μg。用1×PBS溶解适量的MOG 35-55，将其由Eppendorf管转移到5毫升的注射器内，取等体积的CFA(将IFA按照10μg/μl补充适量的MT获得CFA)转移至另外一个5毫升的注射器，注意排尽管内的空气，通过细的连接管将两管连接，先由抗原端推向CFA端，进行乳化，乳化过程中连接管置于冰上，反复抽推直至阻力明显增大，取一滴乳化剂滴入水中，乳化剂呈现球形而不分散则说明乳化完全，如出现平展扩散即为未乳化好，需要继续抽推进一步乳化。

(2)小鼠麻醉  水合氯醛，3μl/g，小鼠腹腔注射。

(3)模型诱导  100μl/只乳化液，双腋下皮下注射；PT 200ng/只，尾静脉注射。

(4)Rg1干预组  诱导当日起，Rg1以10mg/Kg/日对EAE小鼠进行干预