[发明专利]番茄EIL1重组蛋白的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及到分子生物学和基因工程领域中的一种番茄重组蛋白质的制备及其应用。

背景技术

植物果实是人类的重要食物来源，人们希望通过对果实成熟机理的研究，寻求提高果实产量、品质的方法。

乙烯是五大植物激素中最简单的一种，对生长发育的许多过程，特别是果实发育、成熟有着广泛而深远的影响。对乙烯信号通路的深入研究能使更加透彻的阐明果实的生长发育模式和机制。EIN3/EILs蛋白家族是乙烯信号转导途径上一个重要的转录因子，该蛋白家族接受乙烯信号而得到激活，并启动一系列调节乙烯的目标基因的表达，对乙烯反应起正调控作用。

番茄不仅是一种被广泛食用的蔬菜，同时也是一种研究果实发育成熟的重要模式植物。Tieman于2001年从番茄克隆了3个EIN3-Like基因LeEIL1、LeEIL2和LeEIL3，其中LeEIL1基因序列与烟草TEIL基因的同源性为79％，与拟南芥EIN3、EIL1、EIL2和EIL3的同源性分别为59％、56％、52％、和46％。长期以来对番茄EIL1基因的研究大多浅止于转录水平，但对在植物生命活动中直接起作用的EIL1蛋白质却研究甚少。近年来现代分子生物学的研究趋势已从基因组学转向蛋白质组学，蛋白质的功能、结构以及与其他功能因子的相互作用等已经逐渐成为研究重点。如何获得番茄EIL1蛋白质以供研究及其他功用仍然是一项技术空白，因此番茄EIL1重组蛋白质的制备是EIL1功能研究的重要基础，对明确其功能结构及其调控机制具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种番茄EIL1重组蛋白质的制备方法。采用分子生物学方法克隆得到番茄EIL1基因，并构建EIL1重组蛋白质表达工程菌，通过甲醇诱导培养的方式批量获得人工表达的EIL1重组蛋白质。

通过下述方案来实现：

番茄EIL1重组蛋白质的制备，包括如下步骤：

(一)番茄EIL1重组蛋白质表达工程菌的构建

采用pPIC9k为番茄EIL1基因的表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主细胞，构建的番茄EIL1重组蛋白质表达工程菌，在不含组氨酸的MD培养基上筛选阳性转化子，通过G418抗性压力筛选高表达效率的工程菌，最终筛选到能大量表达分泌型的番茄EIL1重组蛋白质的工程菌。

(二)重组蛋白质的诱导表达

富集培养表达工程菌后，将菌体转移到BMMY培养基中，采用0.5％的甲醇诱导表达外源重组蛋白质。

(三)重组蛋白质的分离纯化

将表达产物与His-bind树脂充分混匀，待重组蛋白与树脂充分结合后，采用咪唑梯度洗脱的方式，逐步将杂蛋白洗去，最后采用高浓度咪唑溶液将目的重组蛋白质洗脱，透析过后，经冷冻干燥最终获得番茄EIL1重组蛋白质。

本发明的再一目的在于提供番茄EIL1重组蛋白质的应用。

制备的番茄EIL1重组蛋白质能在多个领域得到应用，例如：

(一)番茄EIN3/EILs蛋白质家族DNA结合功能域(DNA Binding Domain，DBD)及转录活性功能域(Transcriptional Activation Domain，TAD)研究应用

人工合成DNA结合探针，与番茄EIL1重组蛋白相杂交后，经凝胶阻滞分析研番茄EIL1蛋白质的DBD及TAD区域。

(二)番茄EIL1重组蛋白在筛选番茄乙烯应答基因上的应用

将制备的番茄EIL1重组蛋白质固定在基质上，与番茄总DNA相互杂交后，反复洗脱非目的核酸；将EIL1-核酸复合体从基质上洗脱，用蛋白酶消化EIL1重组蛋白，最终获得番茄乙烯应答基因片段。

(三)番茄EIL1单克隆抗体的制备方面的应用

番茄EIL1重组蛋白质能应用于番茄EIL1单克隆抗体的制备，该单克隆抗体在番茄EIL1基因蛋白质表达水平的研究有极重要的作用，具体应用如下：

A、番茄EIL1蛋白质作为免疫原与佐剂混合制成乳剂皮下注射BALB/c小鼠，进行免疫。

B、番茄EIL1蛋白质作为包被原，ELISA检测免疫血清的效价。

附图说明

图1为番茄EIL1重组蛋白质表达载体的结构图。

图2为工程菌诱导表达产物和分离纯化后的番茄EIL1重组蛋白质的SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白质Marker，1：纯化的EIL1重组蛋白质，2-4：工程菌表达产物，C：对照菌表达产物。

具体实施方式

通过附图和实施例对本发明具体实施方式进行说明。

实施例1 番茄EIL1重组蛋白表达载体的构建