[发明专利]番茄EIL1重组蛋白的制备及其应用

权利要求书

1.一种番茄EIL1重组蛋白质的制备方法及其应用，其特征在于一种制备番茄EIL1重组蛋白的方法及重组蛋白相关的应用。

2.权利要求1所述的重组蛋白的制备方法，包括：

(1)融合基因的克隆

设计引物：上游引物PEIL-EcoR I：5’-TTTGAATTCCATCATCATCATCATCATATGATGATGTTTGAGGAAATGGGGTTCAG-3’，下游引物PEIL-Not I：5’-TTCGCGGCCCTAGTACCAAATAGGAGCATC-3’，以番茄cDNA为模板，PCR扩增融合基因。

(2)酵母表达工程菌的构建

采用EcoR I和Not I限制性内切酶双酶切目的基因片段和pPIC9K载体，在T₄连接酶的催化下，16℃连接反应12h。将连接产物与100μL的大肠杆菌JM109感受态细胞混合，采用热激法将重组质粒转化进入JM109宿主细胞，在含有Amp抗生素的LB培养基平板上筛选阳性转化子，进行PCR鉴定，并进行基因测序。重组质粒pPIC9k-EIL1经Sac I酶切后，电转化进入毕赤酵母KM71，涂布于缺乏组氨酸的MD培养基中，挑单菌落进行PCR鉴定，G418梯度抗性压力筛选高表达菌株。

(4)重组蛋白质的诱导表达

将酵母表达工程菌富集培养后，转移至BMMY培养基中，保持终浓度为0.5％的甲醇连续诱导培养4天。

(5)重组蛋白质的分离纯化

使用PEG6000对表达产物进行浓缩，取1mL蛋白质浓缩液，与200μL His-bind树脂充分混匀，室温孕孵1h，使目的重组蛋白质充分与树脂结合。采用漂洗缓冲液(pH7.9，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，0.2M咪唑)反复漂洗树脂，充分洗脱杂蛋白采用洗脱缓冲液(pH7.5，0.5mM NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑)洗脱目的蛋白质。4℃，在去离子水中透析洗脱的重组蛋白质16h，冷冻干燥后，获得番茄EIL1重组蛋白质干粉。

3.权利要求1所述的番茄EIL1重组蛋白的应用，例如：

(1)重组蛋白质在番茄EIN3/EILs蛋白质在DBD和TAD研究领域的应用，其特征在于重组蛋白具有完整的生物活性。

(2)重组蛋白在筛选番茄乙烯应答基因研究领域的应用，其特征在于重组蛋白具有聚组氨酸标签，能吸附于His-Bind树脂，同时具有DNA结合活性，能与乙烯应答基因结合。

(3)重组蛋白在番茄EIL1单克隆抗体制备过程中的应用，其特征在于重组蛋白具有抗原活性。

4.权利要求2中所制备的番茄EIL1重组蛋白，其特征在于一种带有聚组氨酸标签的番茄EIL1重组蛋白质，是由(a)和(b)所组成的蛋白质：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(b)其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，处于(a)肽链的N-端。