[发明专利]一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基于血液代用品的血红蛋白的分离纯化技术，尤其涉及一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法。

背景技术

输血往往是抢救生命的重要手段之一。在我国，各大城市的医院几乎都发生过血荒，一些手术不得不等待血液到来才能实施。血液在低温条件下一般只能保存21天，而且存在艾滋病、肝炎等病毒的传染和血型的匹配问题。因此，制备一种安全有效的血液代用品对输血医学具有十分重要的意义。

血液替代品的研究迄今已有近百年的历史，其研究方向主要有两个：氟碳化合物和血红蛋白Hb制品。氟碳化合物因存在使用不便及容易引起免疫系统功能阻断等毒副作用，阻碍了其进一步应用；血红蛋白制品具有天然血红蛋白的氧结合特性和正常的生理代谢途径，且去除了具有表面抗原的红细胞膜，使输血不再需要配血型，因此血红蛋白类血液替代品比氟碳化合物更符合人体生理需要，目前已经成为国内外的研究热点。血液代用品用于临床输血时，溶液中残留的细胞膜、杂蛋白、热源、内毒素等都会对患者带来致命性的损害，因此以血红蛋白为基础的血液替代品都需要纯化的血红蛋白作为原料，如何获得高质高量的纯化血红蛋白是该课题研究的关键。

目前，血红蛋白的来源主要有三个：第一，过期的人血，由于人血红蛋白来源有限，过期人血更是远远不能满足扩大化生产，还存在人血病原体交叉污染等问题，不可能大批量制备；第二，基因重组人血红蛋白、人血干细胞体外培养人工红细胞等基因工程技术产物，但这些技术在投入工业化生产时，尚存在工艺复杂、产率较低及成本过高等问题，限制了它在血液代用品中的应用；第三，来源广泛的动物血。如有人就曾使用牛血、猪血为原料提取了血红蛋白，并取得了好的效果。猪血红蛋白有85％的氨基酸残基与人血红蛋白同源，经X光晶体衍射分析显示它与人血红蛋白结构极为近似，其氧亲和力调节机制与人血红蛋白相同，且免疫原性比牛血红蛋白低，因此猪血红蛋白是迄今为止发现的人血红蛋白最理想的替代材料。中国是世界上第一养猪大国，猪的数量远远超过了牛，因此采用猪血作为提纯血红蛋白的原料，对于血液代用品的研究具有特别的意义。

目前国外提纯血红蛋白的方法应用最广泛的就是离子交换层析法，需要用到高效液相色谱仪，对仪器设备要求高，无形中增加了成本。而国内除了用到离子交换层析、亲和层析等方法以外，还较多采用了加温、超滤等措施。实践证明：加温后杂蛋白量依然比较大，并且加温后会让部分血红蛋白变性沉淀，而其进一步的超滤除了增加细菌病毒污染外，还提高了生产成本，由于血红蛋白分子量较大，超滤膜很容易被堵住，超滤膜的成本也较高，这样不易扩大生产规模。另外，众所周知，血红蛋白溶液很不稳定，即使在低温下也容易氧化和变性。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法，得到的血红蛋白无基质，无热源，能够安全有效地进行进一步修饰以制造血液代用品，而且操作简便，成本低廉。

为解决上述技术问题，本发明采用的工艺步骤是：

(1)将抗凝猪全血经离心去除血浆、白细胞及血小板，用生理盐水洗涤红细胞2～4次，低速离心后得到压积红细胞；

(2)用2～8倍于压积红细胞体积的低渗溶液溶解压积红细胞，通入惰性气体，在溶血液中加入抗氧化剂，调节溶液pH值至7.0～7.4，再加入保护剂至终浓度为1～5％，加入抑菌药物，充分搅拌1～4小时，高速离心10～30分钟后取上清得到粗制血红蛋白溶液；

(3)往粗制血红蛋白溶液中加入体积是粗制血红蛋白溶液1/10～1/4的甲苯，震荡摇匀后低温条件下萃取2～6小时，取下层血红蛋白溶液；

(4)将血红蛋白溶液装入透析袋中，在加有保护剂和抑菌药物的透析液中透析36～72小时，中间更换1～3次透析液，去除残留甲苯和小分子物质；

(5)将透析后的血红蛋白溶液加入保护剂，冷冻真空干燥成干粉后再溶解成高浓度、小体积的液体，上样于葡聚糖凝胶层析柱纯化，收取分子量均一的高纯度血红蛋白；

(6)将高纯度血红蛋白经过滤除菌去热原，加入保护剂，然后冷冻真空干燥，得到高纯度、无基质、无热源的血红蛋白干粉。

以上各步骤均在2～6℃温度条件下进行。