[发明专利]一种酵母细胞生物合成1，6－二磷酸果糖钠的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种酵母细胞生物合成1，6-二磷酸果糖钠的方法。

背景技术

1，6-二磷酸果糖[Fructose-1，6-Diphosphate，简称FDP]，分子式为C₆H₁₄O₁₂P₂，常以钠、钙、锌等盐的形式存在。系糖代谢的中间产物，溶于水，是人体生命活动所必需的，在细胞代谢过程中起凋节剂、生物催化剂和细胞强壮剂的重要作用。

自1908年Harden和Young发现并阐明1，6一二磷酸果糖的基本特性以来，许多科学家对1，6一二磷酸果糖的制备和应用作了研究。Nenfeng等人于1942年用新鲜的面包酵母或啤酒酵母的酶系在实验室合成了FDP，进一步证实1，6一二磷酸果糖作为糖代谢过程中的中间体的论点，而Markov等人对FDP进行的药理学和药效学研究则为FDP在医学中的应用打下了基础。他们的研究发现FDP可作用于细胞膜，调节糖代谢中若干酶活性，尤其是激活磷酸果糖激酶(PFK)，聚增细胞内高能磷酸根，产生大量的ATP，促进钾离子内流，恢复细胞极化状态，从而有益于休克、缺氧、缺血、损伤、体外循环和输血等状态下的细胞能量代谢以及刘葡萄糖的利用，以促进细胞修复和改善功能。在临床上，FDP作为调节糖代谢中若干酶的活性和恢复、改善细胞代谢的分子水平药物，用于休克、急性心肌梗塞、心肌直视手术、外周血管疾患和重危病人接受胃肠外营养疗法等疾病的治疗和辅助治疗。

八十年代，意大利Foscama公司在FDP的制备技术和临床应用等领域取得突破性进展。在世界上首家实现了FDP的工业化生产，并推出了1，6一二磷酸果糖钠盐的粉针剂，获得巨大成功，其生产量由1986年的2万针上升到1991年的500万针。据统计，1988年我国进口量为10万针，1991年猛增到100多万针，1993年达200万针之多。国内对FDP的研究起步较晚，而国外对FDP的积累机理和生产过程也缺乏系统研究，迄今未见专著。除Foscama公司的Bisso等人在专利中报道了FDP的制备工艺外，未见有系统的文章报道。

80-90年代发现1，6-二磷酸果糖(Fructose-1，6-diphosphate)在医药保健品和植物生长调节方面的诸多用途，尤其用于医药备受关注传统FDP的生产是用面包酵母或啤酒酵母作酶源，通过糖酵解过程而获得，以后有用固定化酵母细胞、固相化多酶系统及嗜热脂肪芽胞杆菌转化葡萄糖为FDP的专利报道，还有采用重组啤酒酵母转化乳糖为FDP及用CTAB代替甲苯改变酵母细胞透性，以葡萄糖为碳源生物合成FDP的研究等。

生物转化是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器，以及游离酶对外源性化合物进行结构修饰的生化反应。一方面天然产物一直是人类寻找有效活性成分的源泉；另一方面，在开发新药的过程中，具有以天然产物为先导化合物，通过化学或生物的手段，对其结构进行修饰，得到根多结构新颖的化合物，进而发现毒性更低，疗效更好的药物。微生物作为一个完整个体，其体积虽小，但也具有一套自身特异的酶体系。同时由于微生物资源丰富、种类繁多，对于特意的底物，可供筛选的菌株很多。以多种不同催化功能的酶系对天然活性成分进行生物转化，可产生新的组合性的天然化合物库，再通过活性筛选，可寻找新的高效低毒的天然活性先导化合物，或通过对活性组分中的不同成分结构变化可以发现新一代的先导化合物，已取得了巨大的社会效益和经济效益。生物转化规律还可以指导新药的结构修饰，获得高效长效的新一代药物，足以说明生物转化对新药开发的重要性。

现报道的转化合成方法大都是采用霉菌菌丝体作为转化的微生物，这类微生物培养烦琐，费时较长，而且不利于操作的简便化，同时生物合成效率不高。

发明内容

本发明提供一种周期短，产量高的酵母细胞生物合成1，6-二磷酸果糖钠的方法。

一种酵母细胞生物合成1，6-二磷酸果糖钠的方法，包括如下步骤：

将梅山酵母或酿酒酵母(酿酒酵母的商品名称为酒精酵母，可采用安琪酵母股份有限公司生产的酒精酵母)接种在发酵培养基上，发酵培养基为糖度为12柏林，pH为6.5的麦芽汁；接种采用的是对数生长期的酵母种子液。于25～30℃、150r/min摇床预培养12～36h得到发酵液；在4℃，10000r/min条件下将发酵液冷冻离心20～30min得到菌体。预培养的时间优选18～24h，最优选24h。