[发明专利]一种抗虫转基因水稻多重PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种可同时检测3～4种抗虫外源基因的转基因水稻多重PCR检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

水稻是最重要的粮食作物之一。自第一批水稻转基因植株在1988年问世以来，中国、日本、泰国、德国、菲律宾、瑞士、英国、美国、加拿大等国家在水稻转基因研究领域取得了一系列成果，许多转基因水稻品种已进入田间实验，并不断向实用化方向发展。我国转基因技术发展很快，其中，水稻转基因技术是我国少数几个具有国际竞争力的转基因技术之一，且倍受关注，已有多份转基因水稻材料获准环境释放，其中4份抗虫转基因水稻和1份抗病转基因水稻已开始申请安全证书。然而，近年来我国相继涌现的“湖北转基因抗虫水稻非法种植”、“亨氏婴儿营养米粉混入转基因成分”等事件，给我国转基因水稻的安全监管提出了十分迫切的要求。为此，开展我国自主开发的主要转基因水稻的检测方法将对我国转基因水稻安全监管具有重要意义。

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是利用一对与目标序列互补的引物，在DNA聚合酶的作用下达到扩增目标靶序列的技术，可用于基因检测。国内外已有多篇关于利用PCR方法对转基因产品进行定性检测的文献报道，但大都是针对一个外源基因进行扩增，即采用单一的一对寡核苷酸引物扩增一个目标靶序列，这一方法通常只针对某种转基因或其产物，只能满足一种或少数几个转基因品种的检测需要，检测方法繁琐，工作程序重复且耗费大量时间，不适合大批量样品的检测，已不能满足当前工作中快速通关的要求。多重PCR(Multiplex Polymerase ChainReaction，MPCR)也称复合PCR，是一种特殊的PCR技术，比单一PCR反应更快捷、更经济，只需1次PCR反应，就能同时检测多个靶标基因。这种方法具有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。目前这项技术在动物病毒性传染病和人类疾病检测中应用较多。邵碧英(2002)等应用多重PCR研究了转基因花卉中几种转基因成分(外源花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、胭脂碱合成酶Nos终止子，新霉素磷酸转移酶基因Npt II)的检测；王媛(2004)、徐景升(2005)、张平平(2007)等采用复合PCR对转基因大豆中转基因成分(CaMV35S启动子、Nos终止子，抗草甘膦的EPSPS基因)进行了研究；吴影等(2006)也对转基因大豆(CaMV35S启动子、Nos终止子，凝集素lectin基因)进行了检测。

应用多重PCR检测转基因的也有报道，但是都有缺点。吴影等(2006)研究了转基因水稻中CaMV35S、NPT II和潮霉素磷酸转移酶基因Hpt的三重PCR分析方法。该报道中只检测了外源启动子和筛选标记基因，忽略了对目标基因的检测。随着转基因技术的发展，目前已获得安全证书的转基因水稻都已剔除了筛选标记基因。因此，该技术从转基因水稻检测的实用角度来看等同于单引物CaMV35s的扩增。李伟丰(2007)等应用多重PCR技术建立了检测水稻种子中CaMV35S启动子、NoS终止子、Hpt、Bt毒蛋白基因Cry1Ab和GUS等外源基因成分的方法。该方法中不同引物所用浓度不同，跨度从0.2～1.5uM，PCR结果利用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术来分析结果，实际操作繁琐且只能检测Bt毒蛋白基因中Cry 1 Ab这一种外源抗虫基因。

针对目前转基因水稻研发的进展，多种Bt基因以及其他抗虫基因已经应用到了水稻转基因研究中，结合我国转基因水稻研发和市场化发展的趋势，开发一种能同时检测转基因水稻中普遍存在的CaMV35S启动子、Nos终止子、Hpt、Bt毒蛋白基因(Cry 1 Ab，Cry 1 Ac或两者的融合基因)以及缸豆胰蛋白酶抑制剂基因Cpti等外源基因成分的方法就显得非常有必要。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、快速、简便、省时省力的抗虫转基因水稻检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种转基因水稻多重PCR检测试剂盒，主要包括下列引物序列：

CaMV-F：  GCTCCTACAAATGCCATCA；

CaMV-R：  GATAGTGGGATTGTGCGTCA；

Nos-F：   CATGACGTTATTTATGAGATGGG；

Nos-R：   GACACCGCGCGCGATAATTTATCC；

Bt-F：    GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；

Bt-R：    CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT。