[发明专利]胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法

说明书

所属技术领域

本发明属生物技术，涉及一种胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养的方法。这种方法能有效地纯化胎盘间充质干细胞和提高其体外的扩增能力。

背景技术

人足月胎盘中存在一种具有多分化潜能的间充质干细胞。相关的研究已经表明这种干细胞可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等。这种干细胞被称为胎盘间充质干细胞(MSCs)，将在医学上具有细胞移植和组织工程化的重大利用价值。

由于目前还尚未发现胎盘间充质干细胞专一的特异性标记分子，因此该干细胞的分离纯化采用的还是间接的方法：传统的方法是采用灌流方法通过脐血管冲出胎盘残留血液后，在分离血液中单个核细胞、并进行贴附培养的基础上，利用间充质干细胞的贴附性在细胞培养瓶内贴壁形成纺锤形的成纤维状细胞，并经过传代贴壁来逐步纯化间充质干细胞。另一类方法是剪切胎盘组织，并用胶原酶或胰酶消化组织后收集分散细胞，再行贴附培养方法进行间充质干细胞分离和纯化。这两种方法简单方便，但是这种方法分离的细胞实质是多种细胞的混合物，而非克隆化的间充质干细胞。这种多细胞混合物的继代培养和扩增能力较低，难以形成真正的间充质干细胞株系。虽然目前尚不清楚胎盘间充质干细胞的特异性标记分子，但公认为其表现为CD31^-、CD34^-、CD45^-、CD29⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD166⁺。根据这些特点，如果能在细胞原代贴附培养、积聚一定的细胞数量基础上，再利用特异的抗体标记免疫磁珠进行分选，则能有效地提高胎盘间充质干细胞的纯化率。

在胎盘间充质干细胞的体外培养和扩增方面，目前一般采用的是含有一定比例(如10-20％等)血清(如胎牛血清等)的培养基(如DMEM-LG等)进行贴壁培养扩增，也有人使用成纤维细胞生长因子(FGF-2)等促进胎盘间充质干细胞的增殖。但是，考虑到将来胎盘间充质干细胞在临床移植应用的需要，采用无血清培养基以及临床级细胞生长因子具有重要的实际应用意义。

发明内容

为了有效提高胎盘间充质干细胞的体外纯化率和扩增能力，本发明的目的是提供一种胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，通过以下方案实现：

取胎盘母体侧蜕膜，剪碎后用0.1％IV型胶原酶消化并收集细胞，以DMEM(Dulbeco′s Modified Eagle Medium)培养基(含10％胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，杭州)和2mML-谷氨酰胺(Sigma，上海)进行贴壁培养，再行负、正向免疫分选结合的方法纯化胎盘间充质干细胞，获得CD34^-CD105⁺细胞，在无血清体外培养体系中继代扩增培养。

本发明对贴壁培养后收获的胎盘间充质干细胞第一步行负向纯化，即进行阴性免疫筛选。所用的阴性免疫筛选是采用CD34标记磁珠(MACS，MiltenyiBiotech Inc.，上海)分选，获得CD34^-细胞。

本发明对再次贴壁培养后收获的胎盘间充质干细胞第二步行正向纯化，即进行阳性免疫筛选。所用的阳性免疫筛选是采用CD105标记磁珠(MACS，Miltenyi Biotech Inc.，上海)分选，获得CD34^-CD 105⁺细胞。

本发明所述的无血清体外培养体系，含有无血清培养基和成纤维细胞生长因子-2(FGF-2，Sigma，上海)，其中无血清培养基含有DMEM/F12(Dulbeco′s Modified Eagle Media/Nutrient Mixture F-12)培养液(GIBCO，上海)、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和非必需氨基酸(Sigma，上海)，其组成比例为DMEM/F12培养液∶1mML-谷氨酰胺∶0.1mMβ-巯基乙醇∶1％非必需氨基酸。无血清培养基与FGF-2比例为无血清培养基：5ng/mlFGF-2。

本发明的另一个目的是提供所述方法在胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养中应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的技术中采用收集胎盘母体侧蜕膜组织细胞后，先进行原代细胞的贴壁扩增，然后再行抗体标记免疫磁珠分选，这样每次只需少量原代细胞(1×10⁵个细胞)就可以达到比较好的分选效果。