[发明专利]应用转基因技术提高水稻植株对稻纵卷叶螟抗性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗虫育种技术领域，尤其涉及应用生物转基因技术提高水稻植株对稻纵卷叶螟抗性的方法。

技术背景

水稻是我国最重要的粮食作物之一，每年的种植面积约占农作物种植面积的三分之一，稻谷产量占粮食总产量的40％左右，因此水稻的高产稳产对于保证粮食安全有着重要的意义。据全国农技中心统计，2007年稻纵卷叶螟来势猛、发生重，在我国长江流域、江淮、西南、华南等稻区大发生，发生程度为近10年最严重年份，对水稻生产构成严重威胁；另据农业部统计，2007年全国防治稻纵卷叶螟面积达5.8亿亩次，比2006年增加了1.5亿亩次。当前面临的问题主要有：(1)稻纵卷叶螟发生呈加重趋势：发生范围广、面积大，迁入早、峰次多，蛾量大、田间虫口密度高，且危害历期长，发生程度超过了大发生的2003年，田间自然为害卷叶率在50％左右，最高达90％，全国损失稻谷达85万吨；(2)农民难以掌握防治方法：由于稻纵卷叶螟防治适期为卵孵化至低龄幼虫阶段，稻农难以掌握田间调查和防治关键技术，往往错过最佳防治时期，影响了防治效果；(3)过分依赖化学农药，导致稻田生物多样性遭到严重破坏。

Cry1A(b)为克隆自苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)，属于革兰氏阳性孢子细菌并经过人工修饰而成的抗虫基因。苏云金杆菌在芽胞形成过程中，可产生伴孢晶体蛋白，具有高度特异杀虫活性，这种蛋白被称作δ-内毒素(ICP)。ICP通常以原毒素形式存在，当昆虫取食ICP后，原毒素在昆虫的消化道内被活化，转型为毒性多肽分子。活化的ICP与昆虫肠道上皮细胞上的特异性蛋白结合，全部或部分嵌合于细胞膜中，使细胞膜产生一些孔道，从而导致细胞由于渗透不平衡而破裂。伴随着上述过程，昆虫幼虫停止进食，最终死亡。

目前已有的研究主要是利用Ubiquitin等组成型启动子驱动的Cry1A(b)抗虫质粒载体导入水稻的转基因研究，并育成了对水稻螟虫具有较强抗性的“克螟稻”等第一代转基因水稻。经鉴定这种转基因水稻虽然对水稻螟虫有较强的抗性，但由Ubiquitin组成型启动子驱动的Cry1A(b)抗虫基因，在水稻植株的根、茎、叶、花粉和种子等植株的所有组织都有较强的表达。因而这种转基因水稻植株所产生的花粉会随桑叶对家蚕产生毒副作用；植株的根会对土壤微生物的生存环境产生一定的影响；生产的大米也能检测到Bt毒蛋白；同时，这类转基因植株在基因转化过程中所利用的Hpt等抗生素抗性基因很难在植株中分离，从而更增加了人们对转基因食品安全性的担忧，存在着一定的潜在风险。

1，5二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)存在于所有高等植物和自养细菌中，是所有光合生物进行光合碳同化的关键酶，也是光合植物叶片中含量最丰富的蛋白质，约占可溶性总蛋白的50％。利用它所编码的基因高效表达特性，来启动外源目的基因在转基因水稻绿色组织中的高效表达非常有效。Rubisco由大亚基rbcL和小亚基rbcS组成，前者由叶绿体基因组编码，而后者由核基因编码，Rubisco启动子已经被克隆(In-Cheol Jang，Won-Bin Choi，Kyung-Hee Lee，Sang Ik Song，Baek Hie Nahm，and Ju-Kon Kim.Plant Physiology，2002，129，1473-1481)，并根据其引导的gus报告基因在转基因水稻中的活性表明，gus基因在转基因水稻的叶片、叶鞘等组织的叶肉细胞内特异高效表达，而茎、根和种子等器官中不表达或者极弱表达，表现出明显的组织特异性。根据PLAC(http://www.dna.afrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)分析，Rubisco启动子在光诱导转录表达或与光合作用相关的转录表达中起着非常重要的作用，使Rubisco启动子调控的外源基因在植物绿色组织中能够特异高效表达。