[发明专利]维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法

说明书

                        技术领域

本发明属于大肠癌肿瘤细胞原代培养技术领域。

                        背景技术

迄今为止，国内外在从大肠癌组织中分离、纯化肿瘤细胞并建立稳定生长的大肠癌肿瘤细胞均没有获得高效的方法。虽然通过大量标本的筛选最终可以建立起细胞系，但巨大的工作量及漫长的筛选时间使其培养效率相当低下。由于原代肿瘤可以很好地保持原始状态的肿瘤生物学特性，对于肿瘤本身研究及各种抗肿瘤药物研究均具有重要意义，寻求一种简便而又高效的原代培养方法非常迫切，并且很多建立在大肠癌细胞系水平的研究也需要在原代细胞水平进一步验证其可靠性。大量资料表明，原代大肠癌培养的难点在于：细菌及成纤维细胞污染，初代细胞生长困难，继代生长缓慢或停滞。而最大的难点在于影响细胞长期生长的继代生长停滞。因很多实验无需长久代次的肿瘤生长，故本研究主要致力于短期存活的大肠癌原代细胞的培养和纯化，可供原代肿瘤的蛋白、DNA、RNA提取，部分免疫学检测等研究。

                        发明内容

本发明目的在于克服现有技术中存在的一些问题，提供一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法的技术方案。

一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1)手术获取新鲜状态肿瘤标本，生理盐水清洗并剪去污秽及坏死区域后，碘伏浸泡消毒5分钟，采用含双抗的PBS清洗液清洗；

2)在含双抗的PBS清洗液中将上述肿瘤标本剪成细小组织块，静置、去上清液，之后再用含双抗的PBS清洗液清洗，离心分离，去上清液；

3)采用胶原酶消化法或组织块贴壁法，在培养液中进行组织贴壁及细胞爬出，所述的培养液为10-20％胎牛血清培养液；

4)在上述培养液中继续培养并纯化处理，维持细胞生长至所需数量。

所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的胶原酶消化法工艺步骤为：

1)根据标本组织块量，按1∶8-12的体积比加入胶原酶消化液，置于37℃水浴摇箱中作用0.5-3小时，至组织块均呈半毛絮状或细小颗粒状，静置，滴管吸弃上清液；

2)离心分离，用滴管吸弃上清液，然后使用无血清DMEM培养液重悬、吹洗混匀，离心，弃上清液；

3)在10-20％胎牛血清培养液中以薄量液体培养方式培养48小时后，弃去原培养液，换入足量新培养液，并每3日换一次培养液；

所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的组织块贴壁法工艺步骤为：

1)经处理后的标本组织加入无血清DMEM培养液重悬、清洗，离心分离，弃上清液；

2)根据标本组织块量，按1∶8-12的体积比加入胶原酶消化液，置于37℃水浴摇箱中作用20-40分钟，使组织块表面间质分离，暴露肿瘤细胞，之后用无血清DEME培养液清洗，静置沉淀、弃上清液；

3)加入纯胎牛血清(FBS)，混匀，使标本组织充分浸润；

4)组织块的种植：将纯胎牛血清(FBS)浸泡的组织块吸至培养瓶或培养皿内，分布均匀，继续滴加纯胎牛血清(FBS)至完全覆盖培养瓶或培养皿底面，将培养瓶或培养皿缓慢倾斜状态放置入培养箱内，使组织块黏附贴壁；

5)6-12小时后，加入10-20％胎牛血清培养液，使组织块刚好被浸没而不至于浮起，重新水平位放入培养箱内培养，根据组织块的多少每隔24-48小时换一次培养液。至组织块贴壁牢固后，加入足量培养液每72小时换液一次。

所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的纯化处理采用机械刮除法，其工艺步骤为：

1)标记：显微镜下观察，用标记笔在培养瓶或培养皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；

2)刮除：弃掉培养液，于超净台内把无菌胶刮或棉签伸入瓶皿中，肉眼观察下，刮除无标记空间；

3)用PBS清洗液清洗，洗除被刮掉的细胞；

4)注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。

所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的纯化处理采用消化排除法，其工艺步骤为：

1)首先用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合消化液漂洗培养细胞，使之浸没细胞，然后弃去消化液，使细胞处于薄层消化液消化状态，在倒置显微镜下定时观察并不时摇动培养瓶；