[发明专利]维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法

权利要求书

1.一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1)手术获取新鲜状态肿瘤标本，生理盐水清洗并剪去污秽及坏死区域后，碘伏浸泡消毒5分钟，采用含双抗的PBS清洗液清洗；

2)在含双抗的PBS清洗液中将上述肿瘤标本剪成细小组织块，静置、去上清液，之后再用含双抗的PBS清洗液清洗，离心分离，去上清液；

3)采用胶原酶消化法或组织块贴壁法，在培养液中进行组织贴壁及细胞爬出，所述的培养液为10-20％胎牛血清培养液；

4)在上述培养液中继续培养并纯化处理，维持细胞生长至所需数量。

2.如权利要求1所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的胶原酶消化法工艺步骤为：

1)根据标本组织块量，按1∶8-12的体积比加入胶原酶消化液，置于37℃水浴摇箱中作用0.5-3小时，至组织块均呈半毛絮状或细小颗粒状，静置，滴管吸弃上清液；

2)离心分离，用滴管吸弃上清液，然后使用无血清DMEM培养液重悬、吹洗混匀，离心，弃上清液；

3)在10-20％胎牛血清培养液中以薄量液体培养方式培养48小时后，弃去原培养液，换入足量新培养液，并每3日换一次培养液；

3.如权利要求1所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的组织块贴壁法工艺步骤为：

1)经处理后的标本组织加入无血清DMEM培养液重悬、清洗，离心分离，弃上清液；

2)根据标本组织块量，按1∶8-12的体积比加入胶原酶消化液，置于37℃水浴摇箱中作用20-40分钟，使组织块表面间质分离，暴露肿瘤细胞，之后用无血清DEME培养液清洗，静置沉淀、弃上清液；

3)加入纯胎牛血清(FBS)，混匀，使标本组织充分浸润；

4)组织块的种植：将纯胎牛血清(FBS)浸泡的组织块吸至培养瓶或培养皿内，分布均匀，继续滴加纯胎牛血清(FBS)至完全覆盖培养瓶或培养皿底面，将培养瓶或培养皿缓慢倾斜状态放置入培养箱内，使组织块黏附贴壁；

5)6-12小时后，加入10-20％胎牛血清培养液，使组织块刚好被浸没而不至于浮起，重新水平位放入培养箱内培养，根据组织块的多少每隔24-48小时换一次培养液。至组织块贴壁牢固后，加入足量培养液每72小时换液一次。

4.如权利要求1所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的纯化处理采用机械刮除法，其工艺步骤为：

1)标记：显微镜下观察，用标记笔在培养瓶或培养皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；

2)刮除：弃掉培养液，于超净台内把无菌胶刮或棉签伸入瓶皿中，肉眼观察下，刮除无标记空间；

3)用PBS清洗液清洗，洗除被刮掉的细胞；

4)注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。

5.如权利要求1所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，

其特征在于所述的纯化处理采用消化排除法，其工艺步骤为：

1)首先用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合消化液漂洗培养细胞，使之浸没细胞，然后弃去消化液，使细胞处于薄层消化液消化状态，在倒置显微镜下定时观察并不时摇动培养瓶；

2)当见到半数成纤维细胞脱落，肿瘤细胞圈周围的细胞呈卷状后，立即加入含血清培养液停止消化，之后轻柔摇动、吹打盘面细胞使成纤维细胞脱落；

3)用PBS清洗液轻柔漂洗，将消化液及游浮细胞完全弃去，重复处理后向原瓶内补加新的培养液继续培养。

6.如权利要求1所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于细胞生长至所需数量后，采用0.25％胰酶-0.02％EDTA的混合消化液消化并收集肿瘤单细胞。

7.如权利要求2所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述培养液为15-20％胎牛血清培养液。

8.如权利要求2所述的一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于所述的胶原酶消化液为含胶原酶1mg/ml和透明质酸酶0.5mg/ml的混合液，过滤无菌后溶于DMEM培养液中。