[发明专利]一种重组猪源抗菌肽PG4及其生物合成方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域重组蛋白质的表达和纯化，尤其涉及一种基因重组猪源抗菌肽及其生物合成方法。

背景技术

哺乳动物抗菌肽是哺乳动物对外界病原物质的侵染而产生的一系列非专一性免疫应答反应的产物，是宿主先天性防御系统的重要组成部分。它具有广谱抑菌，热稳定，强碱性，易溶于水，带正电荷，分子量低，对真核细胞几乎没有毒副作用，仅杀死原核细胞和发生病变的真核细胞等特点。由于它是通过改变细菌脂质膜的渗透性来杀灭原核细胞和发生病变的真核细胞，因而细菌不易形成耐药性，而传统抗生素是靠阻断大分子的生物合成来发挥作用，导致愈来愈多的细菌对其产生了抗药性。此外，抗菌肽为短链多肽，其成分为易被人或动物吸收的氨基酸，解决了药残问题。因此，哺乳动物抗菌肽必将取代传统抗生素成为新一代的抗菌物质。

目前在哺乳动物体内发现的十余种具有抗菌活性的肽都属于Defension(防御素)和Cathelicidins两大家族。猪白细胞源性的抗菌肽Protegrins(简称PG)包括5种，即PG 1～5，最初从猪白细胞中分离得到，近年来在仔猪的淋巴组织中也分离得到其mRNA。PG是Cathelicidins家族中一类富含Cys，Arg的小分子肽，仅含有16～18个氨基酸，相对分子质量约2KD，四个半胱氨酸形成两个分子内二硫键，以维持其反平行β-折叠结构的稳定性。PG具有广谱的杀灭微生物活性，抵抗各种革兰氏阴性菌、阳性菌、真菌以及囊膜病毒，其中包括多种性传播病菌及独特的抗人类HIV病毒的生物学活性。在体外，PG在浓度为0.1～8μg/mL时可杀灭革兰氏病原菌如大肠杆菌、绿脓杆菌、伤寒沙门氏菌、沙眼衣原体和结核分枝杆菌等。PG的抗微生物活性保持在生理盐浓度，不受细胞外阳离子或血清成分的抑制。Steinberg等研究发现PG还具有快速的杀菌活性，可在10min内使细菌的CFU下降3个对数单位，而常规的抗生素庆大霉素或诺氟沙星达到相同的效果则需要数小时以上。研究还发现在含有1/2浓度的MHB培养基中，绿脓杆菌和葡萄球菌连续分别传11代和18代而不产生耐药性，而相同条件下诺氟沙星的MIC则增加10-190倍。PG还可以通过结合LPS来中和内毒素，减轻内毒素血症。这一切使得PG成为具有很大潜力的抗菌治疗药物。

目前，许多抗菌肽正在开发成药，但是抗菌肽天然产量非常低，化学合成抗菌肽价格相当昂贵，这成为开发成药的一个瓶颈，而通过基因工程技术生产抗菌肽具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种在原核体系中表达猪源抗菌肽PG4的生物合成方法，表达后的融合蛋白经溴化氰化学切割、纯化后，可获得具有抗微生物活性的重组PG4多肽。

本发明的技术方案为：一种重组猪源抗菌肽PG4，所述PG4的氨基酸序列为具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。

本发明的一种合成如上所述的重组猪源抗菌肽PG4的方法，包括以下步骤：

(1)将合成的低聚核苷酸经退火处理成为双螺旋的目的DNA单体，应用DNA重组技术，构建抗菌肽PG4原核表达载体；

(2)抗菌肽PG4原核表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，构建表达工程菌；

(3)发酵培养工程菌，进行诱导剂诱导表达；

(4)将步骤(3)所得表达产物经亲和层析纯化、溴化氰化学切割，再纯化后得到重组猪源抗菌肽PG4。

步骤(1)所述的低聚核苷酸为：

PG4-1：

5’-ATTCAGGGATCCATGCGCGGTGGCCGTCTGTGCTATTGTCGCGGTTGGATCTGCTTCTGTGTGGGTCGTTAAAAGCTTAATTCG-3’；

PG4-2：

5’-CGAATTAAGCTTTTAACGACCCACACAGAAGCAGATCCAACCGCGACAATAGCACAGACGGCCACCGCGCATGGATCCCTGAAT-3’。

步骤(1)具体是将目的基因DNA片段和表达载体进行BamH I和HindIII双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化目的片段，经T4 DNA连接酶连接，构建重组抗菌肽PG4原核表达载体，所用原核表达载体为pGEX-2TK-CMS。

步骤(2)具体是将步骤(1)构建的抗菌肽PG4原核表达载体经BamH I和HindIII双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳验证正确，转化入大肠杆菌宿主细胞，构建表达工程菌。