[发明专利]小红参组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于通过组织培养技术的植物再生技术领域，主要是产自云南楚雄地区的小红参的组织培养和幼苗分化技术领域。

背景技术

小红参(Rubia yunnanensis(Franch.)Diels)为茜草科(Rubiaceae)植物云南茜草的全草，其性味甘、苦，微温，主要以根入药，是云南省彝族、白族、普米族、傈傈族等民族共同使用的野生中药材，为临床上常用的典型民族药。彝药名称为乃佐色。具有补血活血，祛风除湿，软坚破积，镇静镇痛的功能，主要用于治疗月经不调、贫血、失眠、跌打损伤、风寒湿痹、筋骨疼痛、半身不遂、角膜云翳、疮疖肿痛、银屑病、肺结核、慢性胃炎、肾炎、尿道炎、膀胱炎、脉管炎(虚寒型)、冠心病、心胶痛、过敏性紫癜、顽固性鼻衄及癌症肿瘤等。小红参目前尚未形成规模种植，主要依靠野生资源，因无序采挖，大量资源濒临枯竭，药材供不应求，价格高，市场需求量大。野生的小红参存在生长年限不一，有效成分含量不稳定、质量不均一、产量不稳定等问题。且种子难萌发(50-60天才出苗)，生育期过长，隔年种子发芽率较低的问题。而人工种植主要采用种子繁殖、枝条扦插、分株繁殖的方法，存在繁殖系数低，耗种量大，成活率低的问题。为此，开展小红参组织培养研究，既可以保护小红参的野生资源量，又可为小红参的大规模种植提供大量优质种苗，实现小红参资源的合理开发利用。

发明内容

本发明的目的正是为了解决上述现有技术存在的不足而提供一种能大幅度提高小红参愈伤组织的诱导率，提高小红参幼苗的分化率，从而实现小红参种苗工厂化快速繁殖的小红参组织培养方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

小红参组织培养方法，方法步骤如下：

①取小红参植株的顶芽或侧芽为外植体，进行清洗消毒，即用洗涤剂溶液浸5分钟，自来水冲5分钟后，用70％酒清浸泡10秒，再用0.2％升汞浸泡8分钟，用无菌水冲洗8～12次；

②将清洗消毒过的小红参的顶芽或侧芽接种到MS或1/2MS的培养基，使用BA 0.05～0.5mg/L或KT 0.05～0.5mg/L+NAA 0.5～3.0mg/L或2，4-D 0.5～3.0mg/L，暗培养10～30天，形成愈伤组织；

③将顶芽或侧芽形成的愈伤组织接种于MS+BA 3.0～5.0mg/L+NAA 1.5～2.0mg/L或KT 1.0～3.0mg/L+IAA 0.1～1.0mg/L培养基中，暗培养一周后，给予2000LX的光照，光照时间12～14小时/天，培养温度25±2℃，愈伤组织分化形成不定芽；

④使用1/2MS培养基，使用NAA 0.5-2.0mg/L激素，添加1g/L的活性碳，光照培养10～30天，形成不定根；

以上各步骤，均在培养基中添加琼脂6.8～12g/L，蔗糖浓度为2～5％，经121℃灭菌15～20分钟，pH 5.6～5.8，光照强度2000LX，光照时间12～16小时/天，培养温度25±2℃。

在组织培养过程中，在所有的培养基中添加1～5g/L的活性碳，20mg/L的维生素C，转接种第一周暗处理，10～20天转种一次，使用8～10g/L的琼脂增加培养基硬度，降低培养温度至23℃。

本发明研究过程中，采用了小红参植株的不同部位植入不同激素组合的培养基进行离体培养并进行对照，用种子、根、根茎、真叶、花、果实、顶芽或侧芽等不同外植体对诱导小红参产生愈伤组织和不定芽，对照实验结果见表1(接种30天后观察统计)。

表1.不同激素组合对不同植株部位产生愈伤组织的影响

由表1可知，在MS+BA0.2+NAA2.0培养基上真叶诱导率可达85％，其次是顶芽或侧芽，诱导率75％，其它三种培养基本均不能诱导愈伤组织产生。花、果实、根、根茎愈伤组织的诱导率都比较低，而种子和茎的诱导率均为零。

本发明还研究了不同基本培养基对离体培养的影响。以真叶为外植体，接种30天后观察并统计，结果如表2所示。

表2.不同基本培养基的培养效果

由表2可知，在BA0.2mg/L+NAA2.0mg/L相同激素水平下，MS基本培养基诱导小红参真叶形成愈伤组织的效果要明显优于1/2MS和N₆两种培养基，愈伤诱导率可达95％，出现愈伤时间提前2～3天，生长量最大。对三种基本培养基的愈伤诱导率进行统计分析，结果为对小红参离体培养采用MS基本培养基最好。

本发明还研究对照了不同激素浓度组合对顶芽或侧芽形成愈伤组织的影响。将外植体接种30天后观察并统计，结果如表3所示。