[发明专利]2型糖尿病疫苗的构建和制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种2型糖尿病疫苗的构建和制备方法，属于医学生物技术领域。 

背景技术

糖尿病已成为继癌症、心脑血管病之后引起死亡的第三大杀手。流行病学研究表明，我国已成为世界上第二大糖尿病国家。目前，我国糖尿病发病人数达4000万，至2010年发病人数将达到6000万，其中90％以上是2型糖尿病，而且随着病程进展，2型糖尿病患者将出现许多严重并发症，肾功能衰竭、心血管疾病和脑血管意外等，严重影响生活质量甚至死亡。 

新近发现，由脂肪组织分泌的脂肪细胞因子视黄醇结合蛋白-4(retinol bindingprotein，简称RBP-4，以下同)是肥胖症和胰岛素抵抗之间的关联因子。在肥胖症和2型糖尿病患者的部分脂肪细胞中，负责转运葡萄糖的GLUT4的表达量低于常人。敲除了小鼠体内的Glut4(也常被称为Slc2a4)基因(adipose-Glut4(-/-)型)后，在小鼠的肌肉和肝脏部位出现对胰岛素的抵抗性。利用DNA阵列技术发现，adipose-Glut4(-/-)型小鼠脂肪组织中的视黄醇结合蛋白-4(RBP-4)的表达量是增加的。另外，在对胰岛素不敏感性增加的小鼠及患有肥胖症、2型糖尿病的患者体内，其血清中RBP-4的含量明显增加。RBP-4的水平还可以受罗格列酮(rosiglitazone，一种胰岛素敏感性药物)的调节以维持正常稳态。通过转基因技术过表达人源RBP-4或将重组RBP-4注射到正常小鼠体内，可以引起机体对胰岛素的抵抗。相反，将RBP-4基因敲除后，机体对胰岛素的敏感性增加。而血清中RBP-4含量的增加，会刺激肝脏表达葡糖异生酶——烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)，并削弱肌肉组织中的胰岛素信号传导途径。因此，RBP-4是一种源于脂肪细胞的“信号”，降低RBP-4的水平则可能成为治疗2型糖尿病的一个新的途径。这种信号对阐明2型糖尿病的发病机理有重要病理生理学意义。 

另外，利用噬菌体展示技术研制基因工程抗原具有多种优势：(1)噬菌体作为表达产物的载体展示的是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应；(2)噬菌体有强的免疫原性，是天然的免疫佐剂，在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体，容易被免疫系统识别；(3)噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应；(4)由于噬菌体颗粒是由感染的细菌细胞分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产抗原用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价抗原；(5)纯化简单、花费少；(6)噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。由于应用噬菌体展示技术研究基因工程抗原具有以上的优点，弥补了传统抗原和其它基因工程抗原产量不高、纯化复杂等缺陷，对新型抗原的开发具有重要意义。 

2型糖尿病已成为我国严重的个人健康问题和社会问题，就目前的药物治疗尚不能治愈2型糖尿病，且长期服药将带来巨大的经济负担。因此，基于新发现的RBP-4在2型糖尿病发病过程中的始动作用，以及RBP-4是通过脂肪细胞分泌到血液中，达到肌肉组织及肝脏发挥功能的特点，我们提出一个预防治疗2型糖尿病的免疫干预新思路，即以RBP-4为靶点，以噬菌体为载体，将RBP-4基因或其表位展示在噬菌体表面，构建成噬菌体为载体的复合抗原，即构建I重组噬菌体疫苗，免疫机体后，产生抗RBP-4或其表位的抗体，中和血液中的RBP-4，降低RBP-4的量，最终逆转或减轻胰岛素抵抗及2型糖尿病，因此用它治疗2型糖尿病，可彻底改变传统药物治疗存在的诸多不足或问题，必将产生极大的经济效益和社会意义。 

发明内容

本发明的第一个目的就是提供一种2型糖尿病疫苗的构建方法。 

本发明的第二个目的就是为解决目前药物治疗2型糖尿病存在的不足，提供一种2型糖尿病疫苗的制备方法，使疫苗免疫机体后，刺激产生针对RBP-4的特异性抗体，从而调节体内的RBP-4水平，从而达到预防和治疗2型糖尿病的目的。 

本发明的第一个目的通过下列技术方案完成：一种2型糖尿病疫苗的构建方法，其特征在于经过下列步骤： 

(1)在蛋白编码序列如下(549bp，编码183个aa)的人视黄醇结合蛋白-4(retinolbinding protein，简称RBP-4，以下同)的编码序列前添加启动密码子ATG：