[发明专利]2型糖尿病疫苗的构建和制备方法

权利要求书

1.一种重组噬菌体RBP/T7的构建方法，其特征在于经过下列步骤：

(1)在蛋白编码序列如下的人RBP-4的编码序列前添加启动密码子ATG：

GAACGTGATTGCCGTGTGAGCAGCTTTCGTGTGAAAGAAAACTTTGATAAAGCGCGTTTTA GCGGCACCTGGTATGCGATGGCGAAAAAAGATCCGGAAGGCCTGTTTCTGCAGGATAACATTG TGGCGGAATTTAGCGTGGATGAAACCGGCCAGATGAGCGCGACCGCGAAAGGCCGTGTGCGTC TGCTGAACAACTGGGATGTGTGCGCGGATATGGTGGGCACCTTTACCGATACCGAAGATCCGGC GAAATTTAAAATGAAATATTGGGGCGTGGCGAGCTTTCTGCAGAAAGGCAACGATGATCATTGG ATTGTGGATACCGATTATGATACCTATGCGGTGCAGTATAGCTGCCGTCTGCTGAACCTGGATGG CACCTGCGCGGATAGCTATAGCTTTGTGTTTAGCCGTGATCCGAACGGCCTGCCGCCGGAAGCG CAGAAAATTGTGCGTCAGCGTCAGGAAGAACTGTGCCTGGCGCGTCAGTATCGTCTGATTGTG CATAACGGCTATTGCGATGGCCGTAGCGAACGTAACCTGCTG；

(2)将添加启动密码子ATG的人RBP-4蛋白基因片段的5’端引入EcoRI的酶切位 点GAATTC，3’端引入HindIII酶切位点AAGCTT，合成插入pGEM-T载体，构建重组质 粒RBP/T；

(3)将合成构建得到的质粒RBP/T转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，克隆扩增， 大量提取质粒RBP/T；

(4)从质粒RBP/T上用EcoRI和HindIII双酶切下目的片段，插入T7噬菌体载体 多克隆位点的EcoR I和HindIII之间，使其位于T7 10B基因的3’端，使人RBP-4蛋 白与T7 10B表达成融合蛋白，构建成为重组噬菌体RBP/T7。

2.根据权利要求1所述的重组噬菌体RBP/T7的构建方法，其特征在于所述步骤 (3)的质粒RBP/T克隆扩增方法是：将合成构建得到的质粒RBP/T转化大肠杆菌TOP10F’ 感受态细胞，涂布LB固体培养基平板Ampr，37℃倒置培养过夜，挑取LB固体培养基平 板Ampr中的单菌落至装有5ml LB液体培养基Ampr的试管中，于恒温摇床37℃， 150rpm/min过夜培养，次日将该5ml菌液接种800ml LB液体培养基Ampr，于恒温摇床 37℃，150rpm/min过夜培养，次日收获菌液，用质粒大量抽提试剂盒从克隆扩增收获的 菌液中提取RBP/T重组质粒。