[发明专利]提高植物吸收和耐受甲醛的方法及其植物表达载体与应用

权利要求书

1、提高植物吸收和耐受甲醛的方法，该方法包括以下步骤：

(1)、DAS的重组载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAS的构建

1)假丝酵母DAS的基因的扩增

从GenBank中查找假丝酵母DAS的全长基因序列，其GenBank登录号为AF086822，并设计序列如下的一对引物：

DAS5：caccgcATGcCTCTCGCAAAAGCTGCTTC

DAS3：ggatccTTATTGATCATGTTTTGGTTTTTC

5’端引物DAS5，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的G改为c由此形成SphI酶切位点；3’端引物DAS3，末端加BamHI酶切位点；以假丝酵母的基因组DNA为模板扩增，得到DAS的全长DNA；

2)、DAS基因的TA克隆

回收并纯化DAS全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-DAS；

3)、入门载体pENTR*-PrbcS-*T-DAS的构建

用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pMD-DAS，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和DAS基因片断，用T4DNA连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和DAS基因片断，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-DAS；

4)、DAS基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAS的构建

通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-DAS亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得DAS基因的植物表达载pK2-35S-PrbcS-*T-DAS，其DAS基因的GenBank登录号为AF086822

重组载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAS，DAS基因上游添加有光诱导型启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T，其后紧接DAS基因；

(2)、DAK基因重组载体pH2-35S-PrbcS-*T-DAK的构建

1)、毕赤酵母DAK的基因的扩增

从GenBank中查找巴斯德毕赤酵母DAK的全长基因序列，其GenBank登录号为AF019198，并设计序列如下的一对引物：

DAK5：CACCGCatgCctagtaaacattgggattac

DAK3：CTCGAGctacaacttggtttcagatttg

5’端引物DAK5，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的t改为C由此形成SphI酶切位点；3’端引物DAK3，末端加XhoI酶切位点；以巴斯德毕赤酵母的基因组DNA为模板扩增，得到DAK的全长DNA；

2)、DAK基因的TOPO克隆

回收并纯化DAK基因片段，通过TOPO克隆技术亚克隆到pENTR-TOPO载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和测序分析获得重组质粒pENTR-TOPO-DAK；

3)、入门载体pENTR*-PrbcS-*T-DAK的构建

用SphI和XhoI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pENTR-TOPO-DAK，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和DAK基因片断，用T4DNA连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和DAK基因片断，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-DAK；

4)、DAK基因植物表达载体pH2-35S-PrbcS-*T-DAK的构建

通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-DAK亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得DAS基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAK，其DAK基因的GenBank登录号为AF019198；重组载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAK中DAK基因的上游添加有光诱导型启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T；

(3)、农杆菌的遗传转化和转化子的检测

制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAS和pH2-35S-PrbcS-*T-DAK转入农杆菌中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子菌落；以农杆菌菌落的裂解液作为PCR反应的模板，用DAS和DAK基因的上下游特异性引物作PCR检测转化子菌落，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物；

(4)、用含有DAS和DAK基因植物表达载体的农杆菌转化植物

分别挑取携带有质粒pK2-35S-PrbcS-*T-DAS和pH2-35S-PrbcS-*T-DAK的农杆菌单菌落接种于液体LB培养基中培养，离心收集菌体，再用MS液体培养基悬浮。用悬浮的农杆菌感染容易分化的植物组织，然后通过组织培养获得小苗，再利用抗生素筛选获得转基因植物；

(5)、DAS和DAK基因在转基因植物中的插入情况和转录水平的检测

用PCR方法对筛选到的转基因植物作进一步的鉴定；首先采用CTAB法提取转基因植物的基因组DNA，然后以植物基因组DNA为模板，用DAS基因和DAK基因的上下游特异性引物作PCR检测，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析；

从转基因植物中抽取总RNA，反转绿成cDNA后用于RT-PCR分析，检测DAS基因和DAK基因在转基因植物中的转录水平；采用TRIzoL Reagent(Invitrogen)提取RNA，以cDNA为模板，用DAS和DAK基因上下游特异性引物作PCR，经RT-PCR确认的转基因植株用于植物对甲醛的抗性和吸收速率的检测。