[发明专利]G6PD缺陷型A375稳转细胞株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及到医学分子生物学技术，尤其是采用siRNA干扰技术构建研究细胞模型。

背景技术

肿瘤细胞是增殖和分化失控的细胞，存在氧化-抗氧化失平衡，如卵巢癌和肾癌细胞还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)及其代谢酶(谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶等)活性的改变与临床分期相关。GSH是真核细胞抗氧化的最主要的机制，其水平的维持主要依赖于NADPH，而后者又主要来源于磷酸戊糖途径。G6PD(glucose-6-phosphatedehydrogenase，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，EC1.1.1.49)是磷酸戊糖途径的关键酶，也是看家酶，在所有组织细胞均有表达，其基因定位于基因高密度区Xq2.8(NM_000402)，全长18kb，由13个外显子和12个内含子组成；mRNA全长2395bp，cDNA为1548bp，编码515个氨基酸。此外，磷酸戊糖途径还提供五磷酸核糖，作为核酸合成的原料，与肿瘤细胞的异常增殖密切相关。

人食管癌细胞G6PD可高于正常10倍以上；将高于对照2-16倍G6PD表达的NIH 3T3细胞注射到裸鼠皮下可快速诱导裸鼠产生肿瘤，而且肿瘤的大小与G6PD活性高低相关。然而，流行病学观察到G6PD缺陷鼻咽癌患者预后较差，复发率高。共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laserscanning microscopy，CLSM)证实G6PD在凋亡的纤维肉瘤细胞低表达。Ohl等在检测人膀胱癌和前列腺癌细胞内看家基因时，发现G6PD表达不稳定并与肿瘤的恶性程度相关。国内张德太发现G6PD的非竞争性抑制剂脱氢表雄酮(Dehydrooepian-drosterane，DHEA)通过抑制细胞G6PD酶活性可减慢Burkit淋巴瘤的生长。

可见，G6PD与肿瘤的发生、发展、临床表现及治疗均有关系。然而，至今尚未阐明G6PD与肿瘤的关系及其机理，甚至有不一致的观点和结论。原因之一可能是肿瘤细胞内源性G6PD的干扰。

至今为止，文献报道的G6PD缺陷细胞有三个来源，均不是人的肿瘤细胞。其一是G6PD缺陷的CJ7小鼠胚胎干细胞(CJ7 G6PDΔES)，由Filosa实验室采用Cre/lox系统介导的位点特异性重组技术，在G6PD-Loxed中瞬时表达Cre重组酶获得，并用于氧化性损伤及其机理的研究。第二是Pandolfi等从小鼠129sv噬菌体基因组文库中分离得到目的基因，构建阳性和阴性选择载体，经电穿孔法转入ABI ES细胞，筛选后从156个单克隆中找到“G6PD null ES cells”，其G6PD表的活性是正常对照的14％，用于G6PD严重缺陷引起的溶血性疾病基因治疗的研究。第三个G6PD缺陷的细胞是中国仓鼠卵巢细胞E89或E48(Chinese hamster ovary cell，CHO)，由Stamato等从含G6PD突变体的CHO细胞筛选得到，其活性约为CHO K1(野生型)的10％，用于电离辐射损伤及其机理研究。至今，在人类肿瘤研究中尚未见G6PD缺陷型细胞的报道。

在我国，恶性黑色素瘤的发病率虽不高约1/10万人口，但呈不断上升趋势，具有恶性程度高、病程进展迅速、易转移、对常规化疗和放疗不敏感、预后差和死亡率高等特点，成为长期困扰医生的难题。黑色素瘤的发病机理及其研究也是亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种G6PD缺陷型A375稳转细胞株，作为模型用于研究G6PD与肿瘤的相关性及其机理。

本发明的另一目的在于提供这种细胞株的构建方法。

本发明所述的G6PD缺陷型A375稳转细胞株是将A375细胞株经siRNA-慢病毒表达系统靶向沉默了内源性G6PD的表达量80％以上，并含有DNA双链片段5’-GATCCCGCCTCAGTGCCACTTGACATTGATATCCGTGTCAAGTGGCACTGAGGCTTTTTTCCAAC-3′和5′-TCGAGTTGGAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACACGGATATCAATGTCAAGTGGCACTGAGGCGG-3′，以及绿色荧光蛋白GFP基因的能发绿色荧光的稳转细胞株。