[发明专利]G6PD缺陷型A375稳转细胞株及其构建方法

权利要求书

1、一种G6PD缺陷型A375稳转细胞株，其特征在于是将A375细胞株经siRNA-慢病毒表达系统靶向沉默了内源性G6PD的表达量80％以上，并含有DNA双链片段5′-GATCCCGCCTCAGTGCCACTTGACATTGATATCCGTGTCAAGTGGCACTGAGGCTTTTTTCCAAC-3′和5′-TCGAGTTGGAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACACGGATATCAATGTCAAGTGGCACTGAGGCGG-3′，以及绿色荧光蛋白GFP基因的能发绿色荧光的稳转细胞株，所述的G6PD缺陷型A375稳转细胞株的构建方法，由以下步骤组成：

一、siRNA序列、DNA模板的设计与合成

用OligoEngine RNAi软件设计针对人G6PD基因3’端非编码区的siRNA：5′-GCCTCAGTGCCACTTGACA-3′，并以siRNA无关序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′为对照，再分别合成两条互补并含siRNA或对照序列的正义链和反义链的DNA模板，中间以10个脱氧核苷酸的Loop结构相连，后接RNA PolyIII转录中止点，并在两端引入BamH I和Xho I酶切位点；对应于人G6PD基因3’端非编码区的siRNA的DNA模板是5′-GATCCCGCCTCAGTGCCACTTGACATTGATATCCGTGTCAAGTGGCACTGAGGCTTTTTTCCAAC-3′和5′-TCGAGTTGGAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACACGGATATCAATGTCAAGTGGCACTGAGGCGG-3′；而对应于对照序列的DNA模板是5′-GATCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTCCAAA-3’和5’-AGCTTTTGGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAACGG-3’；

二、构建siRNA的慢病毒表达载体

上述DNA模板分别经稀释、退火，与线性质粒pRNAT-U6.2/Lenti连接；再转化E.coliDH5α，涂布平板，过夜培养；每组样品挑取两个单菌落经PCR检测，PCR条件为：94℃10min→94℃30s→55℃30s→72℃30s，共33个循环；过夜培养阳性菌落，提取质粒测序鉴定，对于测序正确的阳性克隆，提取纯化不含内毒素的重组质粒DNA；

三、慢病毒颗粒的包装和病毒液的生产

用慢病毒包装质粒混合物和siRNA慢病毒表达质粒共转染293T细胞；24小时换为含1％FBS的DMEM培养液；48小时收集细胞，5000rpm离心5min，0.45μm的PVDF膜过滤上清液后用作待测病毒液；以标准病毒液1×10⁸cfu/L为对照，两组样品按感染复数值设5个梯度：1、3、5、10和20；感染24小时观察绿色荧光细胞的强度和数量以确定病毒滴度，若表达GFP的细胞超过95％，病毒液滴度达1.0×10⁸cfu/L可用于后续实验；

四、病毒颗粒感染A375细胞并筛选稳转细胞株

接种生长状态良好的A375细胞至6孔板，用无抗生素、含10％FBS的DMEM培养基，37℃和5％CO₂培养至70-80％的细胞贴壁；加入病毒液缓慢混匀，24小时换液；84-120小时用500ng/ul的G418筛选；168-200小时挑出单克隆，转移到24孔板；24小时换含抗生素的培养基；当70-80％的细胞贴壁时，转到6孔板中再培养；细胞克隆生长良好时，逐步放大培养；将稳转细胞株反复冻存观察其荧光表达是否稳定，在体外已传代15-20代，荧光表达稳定，siRNA沉默G6PD表达80％以上，成为G6PD缺陷型A375稳转细胞株。