[发明专利]微杆菌及诱变方法与其在手性药物中间体生产上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化烃微杆菌及诱变方法及应用其突变株生产手性药物中间体(1R，4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮的方法。

背景技术

(1R，4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮是一种十分有用的药物中间体，它有两种异构体即(1R，4S)构型和(1S，4R)构型。阿巴卡韦及卡波韦等许多碳环嘌呤和嘧啶核苷酸类似物具有抗HIV效果，(1R，4S)构型的化合物是合成以上药物的原料。对可以立体选择性水解消旋2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮而得到其(1R，4S)构型化合物的产酶菌株进行诱变育种，得到高产菌株，可以降低上述药物的原料成本。在制药行业有实际应用价值，特别对抗艾滋病药物的合成具有重要意义。

从工业化角度看，要求立体选择性水解消旋2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮而得到其(1R，4S)构型化合物的产酶菌株遗传稳定性好，工艺放大容易，这样才能适合工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以立体选择性水解消旋2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮而得到其(1R，4S)构型化合物的产酶菌株的诱变方法与利用其突变株生产手性药物中间体(1R，4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮的方法。

本发明用于转化生产(-)γ-内酰胺的微生物是一种氧化烃微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)(L29-9-B-4)，保藏号为CGMCCNo.2350，保藏日为2008年1月21日。

该菌株具有如下的性质：

形态生理生化特征：

形态特征：杆菌，菌落呈浅黄色，湿润，粘稠，圆形，边缘整齐，不透明。

生理生化特征：革兰氏阳性细菌，产γ-内酰胺水解酶。

本发明所述的该菌株的诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养出发菌株：出发菌株为氧化烃微杆菌(Microbacteriumhydrocarbonoxydans)(L29-9)，保藏号为：CGMCC No.2085；

所述出发菌株的培养参见专利申请“一种微杆菌以及采用该菌种转化生产手性药物中间体的方法”，申请号：200710118064.1，申请日：2007-6-28；在此不再赘述；

(2)上述出发菌株经紫外、紫外和LiCl复合诱变、硫酸二乙酯、亚硝基胍逐级诱变：

紫外线诱变条件：15w，254nm紫外灯20cm处照射90s，避光培养，筛选得诱变菌株L29-9-A；

紫外线、LiCl复合诱变条件：LiCl浓度为1.5％，15w，254nm紫外灯20cm处照射90s，避光培养，筛选得诱变菌株L29-9-A-2；

硫酸二乙酯诱变条件：硫酸二乙酯浓度为1.5％，震荡处理50min，筛选得诱变菌株L29-9-B；

亚硝基胍诱变条件：0.8mg/mL亚硝基胍处理30min，筛选得诱变菌株L29-9-B-4；

(3)培养和筛选

3.1平板筛选培养

平板筛选培养温度为25～40℃，培养1～5天；

平板筛选培养基：Na₂HPO₄·12H₂O 0.7％；KH₂PO₄ 0.2％；MgSO₄·7H₂O 0.02％；CaCl₂·2H₂O 0.001％；FeSO₄·7H₂O 0.0007％；ZnSO₄ 0.000001％；NH₄Cl 0.2％；N-乙酰苯丙氨酸0.5％；琼脂粉2％以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，以碱性物质调pH值为7.0，105kPa灭菌30min；

3.2初筛：

随机挑取平板筛选培养基上长势良好的单菌落于斜面保存培养基上，25～40℃培养25～50小时后，接入种子培养基中25～40℃条件下，摇床振荡培养20～50小时；离心、洗涤并转化γ-内酰胺，用手性HPLC法测定ee值，保存ee值高于90％的菌株进行复筛；

3.2复筛：

挑取初筛得到的菌株接入种子培养基中25～40℃条件下，摇床振荡培养20～50小时，制得种子；以5％体积/体积百分比接种量，接种子于液体发酵培养基中，制得发酵液，离心、洗涤并转化γ-内酰胺，用HPLC法测定酶活，保存酶活最高的菌株；