[发明专利]微杆菌及诱变方法与其在手性药物中间体生产上的应用

权利要求书

1.一种微杆菌Microbacterium hydrocarbonoxydans L29-9-B-4，保藏号为CGMCC No.2350。

2.根据权利要求1所述微杆菌的诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：

其特征在于，包括以下步骤：(1)培养出发菌株：出发菌株为氧化烃微杆菌L29-9，保藏号为：CGMCC No.2085；

(2)上述出发菌株经紫外、紫外和LiCl复合诱变、硫酸二乙酯、亚硝基胍逐级诱变：

紫外线诱变条件：15w，254nm紫外灯20cm处照射90s，避光培养，筛选得诱变菌株L29-9-A；

紫外线、LiCl复合诱变条件：LiCl浓度为1.5％，15w，254nm紫外灯20cm处照射90s，避光培养，筛选得诱变菌株L29-9-A-2；

硫酸二乙酯诱变条件：硫酸二乙酯浓度为1.5％，震荡处理50min，筛选得诱变菌株L29-9-B；

亚硝基胍诱变条件：0.8mg/mL亚硝基胍处理30min，筛选得诱变菌株L29-9-B-4；

(3)培养和筛选

3.1平板筛选培养

平板筛选培养温度为25～40℃，培养1～5天；平板筛选培养基：Na₂HPO₄·12H₂O 0.7％；KH₂PO₄ 0.2％；MgSO₄·7H₂O 0.02％；CaCl₂·2H₂O0.001％；FeSO₄·7H₂O 0.0007％；ZnSO₄ 0.000001％；NH₄Cl 0.2％；N-乙酰苯丙氨酸0.5％；琼脂粉2％；以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，以碱性物质调pH值为7.0，105kPa灭菌30min；

3.2初筛：

随机挑取平板筛选培养基上长势良好的单菌落于斜面保存培养基上，25～40℃培养25～50小时后，接入种子培养基中25～40℃条件下，摇床振荡培养20～50小时；离心、洗涤并转化γ-内酰胺，用手性HPLC法测定ee值，保存ee值高于90％的菌株进行复筛；

3.2复筛：

挑取初筛得到的菌株接入种子培养基中25～40℃条件下，摇床振荡培养20～50小时，制得种子；以5％体积/体积百分比接种量，接种子于液体发酵培养基中，制得发酵液，离心、洗涤并转化γ-内酰胺，用HPLC法测定酶活，保存酶活最高的菌株；

其中液体发酵培养时装液量为40ml/250ml三角瓶，培养温度为25～40℃有氧条件下，摇床振荡培养20～50小时，摇瓶转速为100～300转/分；

种子培养基：Na₂HPO₄·12H₂O 0.7％；KH₂PO₄ 0.2％；MgSO₄·7H₂O 0.02％；CaCl₂·2H₂O 0.001％；FeSO₄·7H₂O 0.0008％；N-乙酰苯丙氨酸0.3％；碳源0.5％；氮源0.5％，以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，以碱性物质调pH值为7.0，105kPa灭菌30min；

液体发酵培养基：Na₂HPO₄·12H₂O 0.7％；KH₂PO₄ 0.2％；MgSO₄·7H₂O0.02％；CaCl₂·2H₂O 0.001％；FeSO₄·7H₂O 0.0008％；N-乙酰苯丙氨酸0.4％；碳源0.6％；氮源0.5％，以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，以碱性物质调pH值为7.0，105kPa灭菌30min。